Le contrôle général non répressible 1 interagit avec le transporteur d'acides aminés cationiques 1 et affecte la fécondité d'Aedes aegypti

May 04, 2023

Parasites & Vecteurs volume 15, Numéro d'article : 383 (2022) Citer cet article

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Le transporteur d'acides aminés cationiques CAT1 (protéine de transport d'acides aminés) fait partie du capteur de nutriments dans le corps gras des moustiques. Membre de la famille SLC7 des transporteurs d'acides aminés cationiques, il est primordial pour la détection des niveaux élevés d'acides aminés dans l'hémolymphe des moustiques après un repas de sang et les modifications ultérieures de l'expression des gènes dans le corps gras.

Nous avons effectué une ré-annotation des transporteurs d'acides aminés cationiques (CAT) d'Aedes aegypti et sélectionné la queue C-terminale de CAT1 pour effectuer un criblage à deux hybrides de levure afin d'identifier les interacteurs putatifs de cette protéine. Une protéine interactive intéressante que nous avons identifiée était le contrôle général non dérépressible 1 (GCN1). Nous avons déterminé le modèle d'expression de GCN1 dans plusieurs organes et structures adultes à l'aide de qRT-PCR et de Western blots. Enfin, nous avons renversé GCN1 à l'aide d'ARN double brin et identifié des changements dans les intermédiaires de signalisation en aval et les effets du renversement sur la vitellogenèse et la fécondité.

Dans un écran pour Ae. aegypti interagissant avec les protéines CAT1, nous avons identifié GCN1 comme un interacteur putatif. GCN1 est fortement exprimé dans les ovaires et le corps gras du moustique. Nous apportons la preuve que la phosphorylation de la sous-unité alpha (eIF2α) du facteur 2 d'initiation de la traduction eucaryote a changé au cours de la vitellogenèse et que l'inactivation de l'interférence ARN de GCN1 chez les moustiques entiers a réduit la taille des pontes d'œufs des moustiques traités par rapport aux témoins.

Aedes aegypti CAT1 et GCN1 sont probablement des partenaires en interaction et GCN1 est probablement nécessaire au bon développement des œufs. Nos données suggèrent que GCN1 fait partie d'un mécanisme de capteur de nutriments dans divers tissus de moustiques impliqués dans la vitellogenèse.

La capacité de détecter les nutriments et de suivre les changements dans les niveaux de nutriments est d'une importance primordiale pour la fonction et la survie des cellules ainsi que pour le maintien de l'homéostasie dans les organismes multicellulaires. Une variété de voies de détection et de signalisation sont utilisées par les cellules eucaryotes pour suivre les concentrations de nutriments spécifiques et le statut énergétique [1]. Les acides aminés sont les éléments constitutifs de toutes les protéines que la cellule produit pour remplir les fonctions nécessaires à la survie et à la croissance. Deux voies de détection d'acides aminés conservées ont été identifiées chez les eucaryotes : (i) la voie de signalisation de la cible mécaniste de la rapamycine (mTOR) complexe 1 (mTORC1) ; et (ii) la voie générale de contrôle des acides aminés (GAAC), qui a été décrite pour la première fois chez la levure et est parfois appelée chez les mammifères la voie de réponse aux acides aminés (AAR) [2,3,4]. Les deux voies régulent la synthèse de nouvelles protéines en réponse à la teneur en acides aminés libres cellulaires, la voie mTORC1 étant connue pour intégrer les apports des facteurs de croissance, du statut énergétique et de la disponibilité des nutriments pour réguler la croissance cellulaire [2,3,4,5].

L'activation de mTORC1 est accomplie par le recrutement du complexe dans les membranes lysosomales, où il est proposé soit de détecter la teneur en acides aminés libres du lysosome, soit d'interagir avec d'autres gènes métaboliques d'acides aminés cytoplasmiques [2,3,4]. Une fois activée, la TOR kinase dans mTORC1 phosphoryle une autre kinase, la protéine ribosomique S6 kinase bêta-1 (p70-S6K), qui à son tour phosphoryle la protéine ribosomique S6, "activant" ainsi la synthèse des protéines [3, 4, 6]. La kinase centrale de la voie GAAC est le contrôle général non dérépressible (GCN) 2 (GCN2), qui est activé en réponse à plusieurs facteurs de stress cellulaires, notamment de faibles niveaux d'acides aminés intracellulaires [7, 8, 9, 10, 11]. GCN2 détecte ces niveaux avec l'aide d'une autre protéine, le contrôle général non dérépressible 1 (GCN1), qui forme un complexe avec plusieurs protéines, y compris GCN2, le contrôle général non dérépressible 20 (GCN20) et les ribosomes, permettant à GCN2 de détecter les ARN de transfert non chargés (ARNt) dans le site A du ribosome [12,13,14,15] et phosphoryler la sous-unité alpha du facteur 2 d'initiation de la traduction eucaryote (eIF2α) en réponse [12,13,14,15,16,17,18]. La phosphorylation de eIF2α provoque une réduction de la traduction générale et améliore la traduction d'un sous-ensemble de gènes, y compris GCN4 (chez les mammifères, activant le facteur de transcription 4 [activant le facteur de transcription 4]) qui répondent aux conditions de privation d'acides aminés [19,20,21,22 ]. Des efforts sont en cours pour comprendre l'ampleur de la diaphonie entre les voies de signalisation mTORC1 et GCN2 [23,24,25,26].

Le moustique femelle de la fièvre jaune (Aedes aegypti) est un excellent système modèle pour étudier les voies de signalisation des acides aminés qui sont actives dans une variété d'organes et de tissus [27, 28]. Les moustiques femelles de cette espèce ont besoin d'un repas de sang pour obtenir les nutriments nécessaires à la production d'œufs. Une fois le sang ingéré dans l'intestin moyen, les nutriments, en particulier les acides aminés des protéines sanguines digérées, sont sécrétés dans l'hémolymphe d'où ils sont absorbés par le corps gras et utilisés pour produire des protéines précurseurs du jaune (YPP). Les YPP sont traitées dans le corps gras, sécrétées dans l'hémolymphe et absorbées par les ovocytes en développement via une endocytose médiée par les récepteurs. Le processus critique de formation du jaune dans les œufs est appelé vitellogenèse [29].

L'absorption d'acides aminés par le corps gras est essentielle pour l'initiation de la vitellogenèse, les acides aminés cationiques étant absolument nécessaires à l'expression des YPP [30, 31]. Le transport des acides aminés cationiques dans le corps gras au cours de la vitellogenèse est facilité par les protéines de la famille des transporteurs de solutés 7 (SLC7), y compris les transporteurs d'acides aminés hétérodimériques (HAT) et les transporteurs d'acides aminés cationiques (CAT) [32]. Les protéines CAT sont des transcepteurs à 14 domaines transmembranaires, c'est-à-dire des transporteurs dont on pense qu'ils agissent également comme des récepteurs [33], dont la spécificité de substrat est déterminée par une région de 80 acides aminés s'étendant de la quatrième boucle intracellulaire aux deux domaines transmembranaires suivants (domaines IX et X) [34]. Il a été démontré que les CAT jouent un rôle important dans Ae. aegypti YPP synthèse au cours de la vitellogenèse, comme démontré par l'inactivation de l'interférence ARN (ARNi) [32]. Cinq protéines CAT ont été classées dans Ae. aegypti [32], et la spécificité de substrat et la dynamique de transport de deux d'entre eux ont été caractérisées [30, 35, 36]. Aedes aegypti CAT 1 (AaCAT1) transporte sélectivement l'histidine [36], tandis qu'Ae. aegypti CAT 3 (AaCAT3) fonctionne comme un transcepteur d'acides aminés cationiques plus général, montrant une légère préférence pour l'arginine [35]. Les profils de substrat des AaCAT restants n'ont pas été classés.

Il a déjà été démontré que les membres de la famille CAT faisaient partie de la voie de signalisation mTOR. Inactivation de l'ARNi d'Ae. aegypti CAT 2 (AaCAT2) et AaCAT3 ont significativement réduit les quantités de p70-S6K phosphorylée après stimulation des corps gras en culture avec des acides aminés [32]. Alors que le lien entre l'absorption d'acides aminés médiée par CAT et la régulation mTOR de l'expression du gène YPP dans le corps gras d'Ae. aegypti a été fermement établi, il n'y a toujours pas d'intermédiaire de signalisation établi expérimentalement entre les CAT et le capteur de nutriments mTOR.

Nous présentons ici des preuves que AaCAT1 interagit avec GCN1 dans Ae. aegypti, et que l'inactivation de GCN1 affecte la signalisation des nutriments et le développement des ovocytes de moustiques.

Des moustiques Aedes aegypti (souche Liverpool) ont été utilisés pour toutes les expériences. Les œufs ont été desséchés pendant au moins 1 semaine avant l'éclosion dans 13 × 20 po. casseroles, dans de l'eau déminéralisée à 27 °C. Les larves ont été nourries avec des granulés de nourriture sèche pour chats Special Kitty (Walmart Stores Inc., Bentonville, AR, USA) tous les 3 jours, et l'eau de chaque casserole a été changée tous les 5 jours. Les pupes ont été séparées dans des plats et stockées dans des cages d'élevage d'insectes Bug Dorm-1 (30 × 30 × 30 cm; Bugdorm, Taichung, Taiwan) et laissées émerger. Les moustiques adultes ont été maintenus dans leurs cages Bug Dorm dans des conditions contrôlées (27 ° C, 80% d'humidité, cycle lumière: obscurité de 14h10) et nourris avec des solutions de saccharose à 20% ad libitum. Des femelles adultes à 5 à 7 jours après l'éclosion ont été utilisées pour toutes les expériences.

Les séquences de protéines CAT d'Aedes aegypti ont été consultées à partir d'une publication précédente [32] et de la base de données de protéines du National Center for Biotechnology Information (NCBI). Les séquences protéiques de Drosophila melanogaster ont été consultées à partir de la version FlyBase FB2021_04 [37]. Tous les Ae. aegypti et D. melanogaster ont été alignées à l'aide du logiciel Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) version 11 [38] en utilisant les paramètres par défaut, et un arbre de jonction voisin a été construit en utilisant les paramètres par défaut de MEGA 11. Nœuds contenant des variants de transcription ou des séquences homologues ont été réduites et les informations d'annotation pertinentes ont été ajoutées manuellement à l'arborescence.

Les ailes, les pattes et la tête de 100 moustiques adultes femelles nourris de sang ont été prélevées et jetées. Le tissu restant a été placé dans des tubes Eppendorf de 2 ml avec 0,5 ml de réactif TRIzol® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Le tissu a été homogénéisé à l'aide d'un moteur sans fil VWR (VWR, Avantor; Radnor, PA, USA; Cat. No. 4774-370) avec des pilons jetables en polybutylène téréphtalate (VWR, Avantor; Cat. No. 4774-358), et un autre 0,5 ml de TRIzol a été ajouté avant que les tubes ne soient mélangés par inversion. L'ARN total a été isolé et précipité en utilisant le protocole d'isolation d'ARN avec TRIzol: chloroforme. Après séparation des phases, la phase aqueuse contenant l'ARN total a été séparée, et un volume équivalent d'éthanol à 100 % a été ajouté à la phase aqueuse et mélangé. Les échantillons ont ensuite été purifiés à l'aide d'un kit Zymo RNA Clean and Concentrator 100 (Zymo Research, Irvine, CA, USA; Cat No. R1019) et un traitement à la DNase dans la colonne a été effectué pour éliminer l'ADN génomique. L'enrichissement de l'ARN messager (ARNm) a été réalisé en utilisant le protocole de purification d'ARN polyadénylé de Takara (Takara Bio USA Inc., San Jose, CA, USA). Les concentrations d'ARN ont ensuite été mesurées sur un spectrophotomètre Nanodrop™ 1000 (Thermo Fisher Scientific).

Des bibliothèques d'ADN complémentaire (ADNc) ont été construites à l'aide du système de bibliothèque Make Your Own "Mate & Plate" (Takara Bio USA Inc.) en suivant les instructions du fabricant. En bref, 2 µl d'échantillon d'ARN purifié, 1 µl de solution d'amorce de désoxythymidine oligomérisée (oligo-dT) (CDSIII) et 1 µl d'eau déionisée ont été incubés pendant 2 min à 72 °C, puis refroidis sur de la glace pendant 2 min avant d'être centrifugés. brièvement à 14 000 g pendant 10 s. Pour compléter le mélange réactionnel, 2,0 µl de solution tampon premier brin 5 ×, 1,0 µl de dithiothréitol (DTT; 100 mM), 1,0 µl de mélange désoxyribonucléoside triphosphate (NTP) (10 mM) et 1,0 µl de transcriptase inverse SMART MMLV ont été ajoutés à la solution. . Le mélange réactionnel résultant a été incubé à 42 ° C pendant 10 min avant d'ajouter 1 ul d'oligo-dT modifié par SMART III. La solution est ensuite mélangée et incubée à 42°C pendant 1 h. Le mélange réactionnel a été chauffé à 75 ° C pendant 10 min pour terminer la synthèse du premier brin, puis refroidi à température ambiante. Enfin, 1 µl de RNase H a été ajouté au mélange réactionnel, qui a été incubé à 37°C pendant 20 min.

La bibliothèque d'ADNc a été générée par amplification PCR longue distance à l'aide du mélange de polymérase Advantage 2 (Takara Bio USA Inc.). Le mélange réactionnel consistait en 2 µl d'ADNc premier brin, 70 µl d'eau déminéralisée, 10 µl de tampon PCR 10× Advantage 2, 2 µl de mélange 50× dNTP, 2 µl d'amorce PCR 5', 2 µl d'amorce PCR 3', 10 µl 10 × Melting Solution et 2 µl 50× Advantage 2 polymerase Mix. L'amplification a été réalisée dans un Eppendorf EPgradient MasterCycler (Eppendorf North America, Enfield, CT, USA) en appliquant les paramètres de cyclage suivants : 95 °C pendant 30 s ; puis 26 cycles de 95 °C pendant 10 s et 68 °C pendant 6 min ; avec un cycle final à 68 °C pendant 5 min.

Topologie membranaire de l'Ae. aegypti La protéine AaCAT1 (XP_021707900.1) a été prédite à l'aide de l'outil de prédiction transmembranaire ExPASy TMHMM v2.0 [39] et de l'outil de prédiction transmembranaire Protter [40], ce qui a permis d'identifier les régions N-terminus, C-terminus et intracellulaires. La fonction TBLASTN du programme NCBI BLAST [41] a été utilisée pour identifier la séquence nucléotidique de la séquence intracellulaire C-terminale chez Ae. utilisation du codon aegypti. Les amorces flanquant la séquence intracellulaire C-terminale ont été conçues à l'aide de NCBI Primer-BLAST [42] et validées de manière croisée avec NetPrimer (http://www.premierbiosoft.com/netprimer/). Des séquences adaptatrices ont été ajoutées aux extrémités des amorces sens et antisens comme spécifié dans le kit Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid (Takara Bio USA Inc.) pour assurer l'insertion du fragment d'appât dans le plasmide appât pGBKT7 pour une utilisation dans le Matchmaker Gold Yeast Kit à deux hybrides. Les séquences d'amorces complètes (avec les régions adaptatrices indiquées en italique) sont les suivantes : avant - 5'-CATGGAGGCCGAATTCCATTCGGTTCTTGGCTCCGGTAGT-3' ; inverse - 5'-GCAGGTCGACGGATCCTACGCCTTTTCGAGTCCTACCATG-3'.

La PCR pour générer le fragment d'appât AaCAT1 a été réalisée à l'aide d'un Eppendorf EPgradient Mastercycler (Eppendorf North America) pour générer le fragment d'appât pour le criblage à deux hybrides. Les amorces appâts ont été utilisées dans la réaction avec les bibliothèques d'ADNc générées à l'étape précédente agissant comme matrice. Le kit de clonage In-Fusion HD (Takara Bio USA Inc.) a été utilisé pour cloner les fragments courts et longs dans le vecteur plasmidique pGBKT7. Le kit Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Takara Bio USA Inc.) a ensuite été utilisé pour transformer les plasmides appâts en cellules de levure compétentes de la souche Y2HGold en suivant les instructions du fabricant.

Des cellules de levure compétentes de la souche YI87 ont d'abord été préparées selon le protocole de transformation de levure dans le Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Takara Bio USA Inc.). Le système de bibliothèque Make Your Own "Mate & Plate" (Takara Bio USA Inc.) a ensuite été utilisé pour achever la construction de la bibliothèque à deux hybrides en suivant les instructions du fabricant.

Le Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Takara Bio USA Inc.) a été utilisé pour accoupler les souches de levure appât (Y2HGold) et proie (Y187) en suivant les instructions du fabricant. Les levures accouplées ont ensuite été étalées sur un milieu de croissance synthétique défini (SD) dépourvu de leucine et de tryptophane (support à double goutte [DDO]) complété par de l'auréobasidine et du X-alpha-Gal, un substrat chromogène de l'enzyme α-galactosidase.

Pour éliminer les faux positifs potentiels, des colonies bleues ont été prélevées et appliquées sur du DDO frais dépourvu d'adénine et d'histidine (milieu quadruple drop out [QDO]). Les colonies patchées ont été cultivées sur du milieu QDO pendant 3 jours avant un autre cycle de sélection pour les colonies bleues. Parce que la levure peut porter plusieurs plasmides distincts, il était nécessaire de sélectionner tous les plasmides proies sans interaction qui peuvent être hébergés par des colonies bleues après la croissance sur des milieux QDO. Pour ce faire, des colonies bleues ont été prélevées sur des supports QDO et patchées sur des supports DDO frais. Les colonies ont été patchées deux fois sur du milieu DDO frais, et seules les colonies bleues à la fin de cette sélection ont été conservées pour l'analyse des interactions possibles.

Après deux cycles de sélection sur DDO, la composition de l'insert de proie des colonies bleues restantes a été vérifiée par PCR de colonie à l'aide du Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 (Takara Bio USA Inc.). Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur un tampon Tris-acétate d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (TAE) agarose/gel SYBR Safe à 1 %. L'apparition de plus d'une bande était une indication de la présence de plus d'un plasmide proie dans une cellule. Les produits de PCR qui ont produit des bandes uniques ont été purifiés et envoyés aux Molecular Cloning Laboratories (MCLAB) pour le séquençage. NCBI BLAST [43] a été utilisé pour identifier l'Ae. séquences de gènes aegypti correspondant aux données de séquence de plasmide proie. Un ensemble d'interacteurs putatifs AaCAT1 a été sélectionné à partir de cet ensemble de données en supprimant les faux positifs évidents, tels que les colonies contenant des plasmides sans insert de moustique connu, et des interacteurs connus pour se localiser sur le cytosol et la membrane plasmique ont été sélectionnés, car ces deux emplacements représentent les régions où les protéines sont les plus susceptibles d'interagir avec AaCAT1.

L'isolement des protéines des moustiques dans les expériences décrites ici a été réalisé comme suit. Les pattes, les têtes et les ailes ont été retirées des moustiques et les structures ont été disséquées selon les besoins pour chaque test décrit dans les résultats. Les organes et les structures disséqués ont été homogénéisés à l'aide d'un moteur sans fil VWR (VWR, Avantor ; Cat. No. 4774-370) avec des pilons jetables en polybutylène téréphtalate (VWR, Avantor ; Cat. No. 4774-358) dans 100 µl de tampon de lyse (50 mM Tris, pH 7,4 ; 1 % d'octylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol, ramifié [IGEPAL] ; 0,25 % de désoxycholate de sodium ; 150 mM de NaCl ; 1 mM d'EDTA) additionné de 1 µl de cocktail d'inhibiteurs de protéase HALT™ et de cocktail d'inhibiteurs de phosphatase HALT™ (tous deux de Thermo Fisher Scientific). Les échantillons homogénéisés ont été centrifugés pendant 10 min à 12 700 tr/min et 4 °C pour sédimenter les débris. Le surnageant contenant les protéines a été collecté et la concentration en protéines a été déterminée avec un kit d'analyse de protéines Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientific) sur un spectrophotomètre NanoDrop™ 1000 (Thermo Fisher Scientific) en utilisant le programme Protein BCA.

Un fragment d'appât C-terminal AaCAT1 marqué à la 6-histidine (6-His) ([NH2]HHHHHHHSVLGSGSQTLSESQLENPFCMVGLEKA[COOH]) a été synthétisé sur mesure (Pierce Biotechnology, Thermo Fisher Scientific) et utilisé en conjonction avec une protéine Pierce™ Pull-Down PolyHis : Kit d'interaction protéique (Pierce Biotechnology, Thermo Scientific) avec plusieurs modifications.

Un ensemble d'échantillons de protéines ont été réticulés à l'appât AaCAT1 étiqueté 6-His avant le pull-down. En bref, 1 mg d'agent de réticulation disuccinimidylsulfoxyde (DSSO) a été dissous dans 51,5 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer une solution mère de 50 mM. Ensuite, environ 800 µg d'isolat de protéines totales provenant de corps gras ont été mélangés avec l'extrémité C-terminale CAT1 étiquetée 6-His à une concentration de 200 µg/ml dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) pour générer deux échantillons de corps gras. Une aliquote de 50 µl d'agent de réticulation dissous a été ajoutée à un échantillon de corps gras, et 50 µl de DMSO ont été ajoutés à un corps gras non réticulé comme témoin. Les échantillons ont été incubés à 4 ° C pendant la nuit pour faciliter la réticulation avant utilisation dans les réactions de pull-down. Pour les pull-downs de protéines, 500 µl de résine de cobalt His-Pur par échantillon ont été centrifugés pendant 2 min à 700 g et à température ambiante, et le surnageant a été retiré du lit de résine. Ensuite, la résine a été équilibrée dans 500 ul de tampon de lavage (mélange 1: 1 de TBS: tampon de lyse Pierce plus 5 mM d'imidazole) et centrifugée en utilisant les mêmes réglages que ci-dessus. Le tampon de lavage a été retiré et les échantillons de protéines ont été ajoutés à la résine et mélangés à température ambiante avec un léger balancement pendant 1 h pour faciliter la liaison des protéines réticulées 6-His-tagged aux perles de résine His-Pur. Après mélange, les échantillons ont été centrifugés comme ci-dessus, et le surnageant a été recueilli et conservé. Les billes ont été lavées 3 fois avec 200 ul de tampon de lavage à chaque fois, et après chaque lavage, les échantillons ont été centrifugés comme décrit ci-dessus, et le surnageant a été collecté et conservé à chaque fois. Enfin, les protéines liées ont été éluées dans 100 ul de tampon d'élution (tampon de lavage contenant 290 mM d'imidazole). Après remise en suspension des billes dans le tampon d'élution, les échantillons ont été centrifugés comme décrit ci-dessus et le surnageant a été recueilli.

Un deuxième ensemble d'échantillons de protéines a été tiré vers le bas sans réticulation. En bref, trois tubes Eppendorf de 1,7 ml (témoin d'appât uniquement, contrôle de résine et pull-down) ont chacun été remplis de 200 µl de résine HisPure Cobalt et équilibrés avec cinq lavages de 1,2 ml de solution de lavage (mélange 1:1 de TBS : Pierce Lysis Buffer plus 5 mM d'imidazole). Environ 500 µg de protéine d'appât ont été ajoutés aux tubes de contrôle et de tirage d'appât uniquement, et un volume équivalent de solution de lavage a été ajouté au tube de contrôle en résine. Tous les tubes ont été incubés à 4 ° C avec un léger balancement pendant 2 h pour faciliter la liaison des peptides appâts marqués 6-His à la résine HisPure Cobalt. Après incubation, le surnageant a été éliminé et les billes ont été lavées une fois avec 400 ul de solution de lavage. Environ 2 mg de lysat de protéines totales (voir ci-dessus pour le protocole d'extraction des protéines) ont été ajoutés à la fois au contrôle de la résine et aux tubes déroulants et un volume équivalent de solution de lavage a été ajouté au tube de contrôle d'appât uniquement. Tous les tubes ont été incubés à 4 ° C avec une légère oscillation pendant la nuit pour faciliter l'interaction entre les appâts immobilisés et les protéines proies. Le lendemain, les billes ont été transférées dans les colonnes de centrifugation fournies et le flux de chaque échantillon a été collecté après centrifugation. Un tampon de lavage (250 ul) contenant 290 mM d'imidazole a été ajouté à chaque colonne, et les colonnes ont été incubées à température ambiante pendant 5 min avec un léger balancement suivi d'une centrifugation pour recueillir les protéines éluées.

Amorces d'ARN double brin (ARNdb) conjuguées à T7 pour Ae. aegypti GCN1 ont été conçus à partir d'ARNm (accès à la séquence de référence GenBank : XM_001651776.2), et les amorces d'ARNdb de la protéine fluorescente verte (GFP) ont été extraites d'une étude précédente [44] (tableau 1). As totale. aegypti et un plasmide contenant de la GFP (3 'EGFP pXOON) ont été utilisés comme modèles pour produire de l'ADNdb marqué T7 à utiliser dans la synthèse d'ARNdb à l'aide du kit Megascript ™ RNAi (Thermo Fisher Scientific) en suivant les instructions du fabricant. Des moustiques femelles adultes ont été injectées par voie orale avec 1 µl d'environ 1 µg/µl d'ARNdb par voie intrathoracique à l'aide de capillaires en verre tiré et ont reçu 1 h pour récupérer dans des cages d'élevage d'insectes Bug Dorm-1 avec 20 % de saccharose fourni. Après 1 h, tous les moustiques qui n'avaient pas récupéré ont été jetés. Les moustiques injectés survivants ont été maintenus en utilisant les conditions d'élevage décrites ci-dessus jusqu'à leur utilisation dans des expériences ultérieures. Toutes les injections ont été effectuées chez des femelles 5 à 7 jours après l'éclosion pour normaliser l'âge des moustiques avec toutes les autres expériences réalisées.

La protéine totale a été isolée comme décrit ci-dessus à partir de pools de divers organes ou structures pour chaque essai. La protéine totale a été mélangée avec un volume équivalent de tampon Laemmli 1: 1: bêta-mercaptoéthanol et chauffée à 95 ° C pendant 10 min pour dénaturer les protéines. Les échantillons ont été chargés dans des gels d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) et ont fonctionné à 100 V pendant 90 min (GCN1) ou 60 min (toutes les autres protéines ) à l'aide d'une source d'alimentation PowerPac™ HC (Bio-Rad Laboratories) pour séparer les protéines. Les protéines ont été transférées du gel sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) à l'aide de piles de transfert pré-préparées (Bio-Rad Laboratories) dans un système de transfert Trans-Blot® Turbo™ (Bio-Rad Laboratories) en utilisant le transfert standard préréglé de 30 minutes. courir. Les membranes PVDF ont été lavées 3 fois pendant 5 min dans 1 × TBS + 0,05% Tween-20 (TBST) et bloquées dans StartingBlock ™ T20 (TBS) (Thermo Fisher Scientific) pendant 1 h à température ambiante avec un léger balancement. Les membranes ont été incubées avec un anticorps primaire (tableau 2) dilué dans un tampon de blocage à 4 ° C pendant une nuit sous agitation douce, suivi de trois lavages de 5 min chacun dans du TBST, puis par incubation avec un anticorps secondaire approprié (tableau 2) dilué dans un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante sous agitation douce. Les membranes ont ensuite été lavées 5 fois pendant 5 min à chaque fois dans du TBST pour éliminer tout anticorps secondaire libre, puis incubées dans une solution de substrat de transfert TMB en 1 étape Pierce (Thermo Fisher Scientific) pour une détection colorimétrique jusqu'à 30 min à température ambiante avec Doux bascule. Alternativement, les transferts ont été incubés dans du substrat chimioluminescent Li-Cor WesternSure® PREMIUM (Li-Cor, Lincoln, NE, USA) pendant 5 min à température ambiante, après quoi les membranes colorées ont été imagées à l'aide d'un scanner C-DiGit Blot (Li- Cor) et le logiciel Image Studio™ (Li-Cor) ; les intensités de pixels ont été déterminées à l'aide de ce logiciel pour des mesures de densitométrie semi-quantitatives.

Les organes et les structures des moustiques ont été disséqués et l'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne). Dix organes et structures ont été regroupés pour générer des échantillons individuels, et une taille d'échantillon de trois a été utilisée pour toutes les expériences quantitatives de PCR de transcription inverse (qRT-PCR). Les concentrations d'ARN et d'ADN génomique potentiel ont été mesurées à l'aide d'un Qbit 2.0 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) et la qualité de l'ARN a été confirmée à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). Une aliquote de 250 ng d'ARN de chaque échantillon a été transcrite à l'aide d'iScript™ Reverse Transcription Supermix pour RT-qPCR (Bio-Rad Laboratories) afin de générer de l'ADNc. Pour confirmer l'absence de contamination de l'ADN génomique, des échantillons non transcrits inversement (noRT) ont été générés avec iScript™ noRT Supermix (Bio-Rad Laboratories). Les amorces pour gcn1 ont été conçues à l'aide de PrimerBLAST [42] et évaluées avec NetPrimer (Premier Biosoft, Palo Alto, CA, USA). Des amorces ont été conçues pour flanquer des séquences d'introns afin de faire la distinction entre les produits d'amplification d'ARNm et d'ADN génomique. Des amorces pour les gènes de la vitellogénine (vg), de la bêta-actine (β-actine) et de la protéine ribosomique S7 (rps7) ont été publiées précédemment [45, 46] (voir le tableau 3 pour toutes les séquences d'amorces). Toutes les amorces qRT-PCR ont été synthétisées à l'échelle de 10 nmol avec une purification par dessalage standard (Eurofins Genomics, Louisville, KY, USA).

Étant donné que l'expression du gène de référence peut différer entre différents organes ou à différents moments de la vitellogenèse, l'outil RefFinder [47] a été utilisé pour identifier le gène de référence exprimé le plus stablement pour chaque test qRT-PCR. Pour le profilage de l'expression de gcn1 dans les organes et les structures adultes, rps7 a été déterminé comme étant la référence appropriée, tandis que la β-actine a été déterminée comme étant la référence appropriée pour le dosage de la transcription vg après un traitement à l'ARNi. Toutes les analyses de qRT-PCR ont été réalisées en diluant l'ADNc 1:1 dans de l'eau sans nucléase et en mélangeant les composants suivants dans des plaques transparentes à 96 puits (Genesee Scientific, El Cajon, CA, USA) sur de la glace : 5 µl iTaq Universal SYBRgreen Supermix ( Bio-Rad Laboratories), 1 µl d'amorces spécifiques de gènes directs et inverses mélangés 1:1, 1 µl d'ADNc dilué et 2 µl d'eau sans nucléase. Les plaques ont été brièvement centrifugées pour recueillir tout le matériel au fond des puits et scellées avec un film adhésif en plastique transparent ThermalSeal RTS™ (Excel Scientific Inc., Victorville, CA, USA). Tous les tests qRT-PCR ont été exécutés sur un système de détection PCR en temps réel CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories) contrôlé par un ordinateur à l'aide du logiciel CFX Maestro (Bio-Rad Laboratories) et le profil de cycle suivant : une dénaturation initiale à 95 °C pendant 30 s ; suivi de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 5 s et d'un combiné recuit/élongation à 60 °C pendant 30 s. Une mesure de fluorescence a été effectuée après chaque étape d'allongement. Des courbes de fusion de 65 ° C à 95 ° C par incréments de 0, 5 ° C avec un maintien de 5 s à chaque étape ont été réalisées immédiatement après chaque qRT-PCR. L'efficacité d'amplification des paires d'amorces a été déterminée à l'aide des données brutes de fluorescence dans l'outil Real-Time PCR Miner [48]. Les valeurs moyennes du cycle de quantification (Cq) des répliques techniques de chaque échantillon ont été analysées à l'aide des efficacités de paires d'amorces déterminées par l'outil Real-Time PCR Miner, et les valeurs gcn1 ou vg Cq ont été normalisées aux valeurs rps7 ou β-actine Cq, respectivement, pour quantifier les changements dans l'expression des gènes.

Des groupes de femelles Ae. aegypti (5 à 7 jours après l'éclosion) ont reçu une injection d'ARNdb GCN1 ou d'ARNdb GFP comme décrit dans le texte ci-dessus. Cinq jours après l'injection (PI), les moustiques survivants des deux groupes ont été nourris de sang pendant 1 h avec du sang bovin défibriné (HemoStat Laboratories, Dixon, CA, USA) réchauffé à 37 ° C. Les moustiques engorgés individuels ont été déplacés vers des chambres de ponte et maintenus dans les conditions d'élevage décrites ci-dessus pendant 96 h pour leur assurer un temps suffisant pour terminer la vitellogenèse et la ponte. Les papiers d'oeufs de chaque chambre d'oeufs ont été collectés et desséchés pendant 96 h avant le comptage pour la détermination de la taille moyenne des couvées de chaque traitement. Après comptage, les œufs ont été desséchés pendant au moins 72 heures supplémentaires (total d'au moins 1 semaine de dessiccation). Pour déterminer les taux d'éclosion, 12 papiers d'œufs de chaque traitement ont été sélectionnés au hasard et placés dans de petits plats contenant de l'eau déionisée et un quart de pastille de nourriture pour chats Special Kitty (Walmart Stores Inc.) et laissés éclore. Le nombre de larves de chaque couvée d'œufs a été comparé au nombre d'œufs comptés dans chaque couvée pour calculer les taux d'éclosion.

Les moustiques femelles 5 à 7 jours après l'éclosion ont reçu une injection d'ARNdb GFP ou GCN1 comme décrit ci-dessus. A 5 jours PI, les moustiques femelles ont reçu un repas de sang et on les a laissées se nourrir pendant 1 h. Juste avant le gavage, un groupe de femelles injectées a été isolé pour être utilisé comme échantillon de base non nourri. Des groupes de 10 moustiques nourris au sang ont été échantillonnés à 24, 48 et 72 h après le repas de sang (PBM). Les moustiques de chacun des deux traitements par injection (GFP ou GCN1 dsRNA) et de quatre points de temps (à jeun, 24 h PBM, 48 h PBM, 72 h PBM) ont été anesthésiés sur de la glace et leurs ovaires ont été disséqués. Les deux ovaires de chaque moustique (n = 10) ont été mesurés et moyennés pour déterminer la longueur moyenne des ovaires par moustique pour chaque traitement et moment. Cinq ovocytes par moustique (n = 10) ont été mesurés pour déterminer la longueur moyenne des ovocytes de chaque moustique pour chaque type de traitement et chaque moment.

Des tests de normalité des distributions de toutes les données ont été effectués à l'aide de tests de Shapiro-Wilk et de tracés QQ avant la sélection de tests statistiques supplémentaires. Les données GCN1 qRT-PCR provenant d'organes et de structures de femmes adultes ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA), et des différences significatives entre les échantillons ont été déterminées à l'aide d'un test post hoc HSD de Tukey. Les différences dans les niveaux d'eIF2α phosphorylé entre les échantillons injectés d'ARNdb GCN1 et GFP à différents moments PBM mesurés par densitométrie de bande Western blot ont été analysés à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test post hoc HSD de Tukey pour identifier toute différence significative entre les traitements à chaque instant. . Les différences d'expression de vg entre les échantillons injectés d'ARNdb GCN1 et GFP mesurées par qRT-PCR ont été analysées à l'aide de tests t non appariés à chaque instant. Les différences de longueur des ovaires et des ovocytes des moustiques injectés d'ARNdb GCN1 et GFP ont également été analysées à l'aide de tests t non appariés à chaque instant. Les différences dans le nombre d'œufs et les taux d'éclosion ont été analysées à l'aide des tests U de Mann–Whitney. Les courbes de survie des moustiques injectés d'ARNdb ont été analysées à l'aide d'un test Log-rank Mantel-Cox. Les valeurs P < 0,05 devaient être considérées comme statistiquement significatives pour tous les tests. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel d'analyse statistique Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Dans des publications précédentes, nous avons annoté la famille complète des gènes SLC7 chez Ae. aegypti [32] et identifié les affinités de substrat et les activités de transport de deux des cinq CAT annotés [35, 36]. Suite à ces études, de nouvelles annotations génomiques ont été publiées pour Ae. aegypti [49, 50]. Étant donné que certaines de ces annotations automatiques attribuaient des numéros incohérents à des CAT particuliers, nous avons choisi de ré-annoter nos enregistrements CAT précédents [32] avec les annotations actuelles disponibles dans Entrez Gene et avec les groupes CAT actuels de D. melanogaster de la version FlyBase FB2021_04 [ 37] pour le contexte évolutif (voir Fichier complémentaire 1 : Tableau S1). L'alignement de protéines multiples dans MEGA11 [38] a révélé que AaCAT1 et AaCAT3 se regroupent le plus près de D. melanogaster Slimfast (Slif) (Fig. 1a), et représentent donc probablement une duplication de gène à partir d'un ancêtre commun après la scission évolutive entre les mouches et les moustiques. , il y a 250 millions d'années (MYA) [51]. De plus, au cours de cette analyse, nous avons identifié deux entrées génétiques distinctes pour Ae. aegypti CAT2 et deux entrées génétiques distinctes pour Ae. aegypti CAT3 dans la base de données Entrez Gene. Notre arbre de jonction voisin regroupait un Ae. aegypti CAT2 (GeneID : 5575859) avec notre annotation AaCAT1 [32], tandis que l'autre Ae. aegypti CAT2 (GeneID : 5571884) regroupé avec notre annotation AaCAT2 [32] (Fig. 1a). De plus, l'un des deux Ae. aegypti annotations CAT3 (GeneID : 5575863) regroupées avec notre annotation AaCAT3 [32], tandis que l'autre Ae. aegypti annotation CAT3 (GeneID : 5575110) regroupée avec notre Ae. aegypti cationic amino acid transporter 5 (AaCAT5) annotation [32] (Fig. 1a).

AaCAT1 phylogénie et écran d'interaction. a AaCAT1 et AaCAT3 représentent une extension de la famille Drosophila Slif CAT. Les séquences de protéines CAT d'Aedes aegypti ont été téléchargées à partir de la base de données de protéines NCBI, et les séquences de protéines CAT de Drosophila melanogaster (Dmel) ont été consultées à partir de la version FlyBase FB2021_04 [37]. Les séquences de protéines ont été alignées à l'aide de MEGA11 [38], et un arbre de jonction voisin a été généré dans MEGA11 à partir de l'alignement de séquences multiples. Les nombres à côté de chaque nœud représentent les valeurs d'amorçage basées sur 500 réplications. AaCAT1 et AaCAT3 ont déjà été annotés comme Slif dans Ae. aegypti. Notre assemblage actuel montre que les deux transporteurs partagent une homologie avec D. melanogaster Slif et représentent une expansion de la famille des transporteurs Slif pendant Ae. évolution aegypti. La boîte rouge autour de AaCAT1 indique son utilisation dans notre test d'interaction protéique. Tous les noms de gènes non précédés de Dmel sont Ae. aegypti CAT annotations. Les parenthèses autour des groupes de gènes représentent nos ré-annotations suggérées d'Ae. aegypti CAT basés sur cet arbre. b Structure transmembranaire prédite de AaCAT1. L'application Web Protter [40] a été utilisée pour illustrer les 14 hélices transmembranaires. Le site de spécificité de substrat a été marqué [34], et le fragment C-terminal de 28 acides aminés utilisé comme appât dans le test Y2H est indiqué par des cercles contenant leur code d'acides aminés à une seule lettre. c Tableau contenant les cinq principales protéines interagissant avec au moins deux résultats distincts déterminés par le test Y2H. d Fragment d'appât AaCAT1 pour les pull-downs et les fragments d'interaction GCN1. e Analyse déroulante de l'interaction AaCAT1-GCN1. Le domaine C-terminal AaCAT1 a été incubé avec des protéines de corps gras et les complexes résultants capturés sur de la résine de cobalt. La coloration au bleu de Coomassie des réactions de pull-down réticulées (liées à l'x) et non réticulées (non) à l'aide d'un fragment d'appât AaCAT1 étiqueté 6-His (identique à d) et de la protéine du corps gras révèle une bande éluée à la taille attendue pour l'interaction GCN1 (marquée par une flèche). f GCN1 se lie à l'extrémité C-terminale de AaCAT1. Western blot des fractions de test pull-down confirme la présence de GCN1 dans la fraction d'élution pull-down (marquée par une flèche). appât, contrôle des appâts uniquement ; FT, fraction d'écoulement ; élution, fraction éluée ; PD, déroulant ; résine, contrôle de la résine; lavage, fraction de lavage de résine ; Y2H, bi-hybride de levure ; pour les autres termes, voir Abréviations

L'analyse in silico de la séquence d'acides aminés AaCAT1 à l'aide de l'outil de visualisation moléculaire PyMOL (https://pymol.org/2/) et de l'outil de prédiction transmembranaire TMHMM v2.0 [39] nous a permis de prédire la structure tertiaire de la protéine ( Fichier supplémentaire 1 : Figure S1a), ainsi qu'identifier les régions transmembranaires, intracellulaires et extracellulaires de la protéine (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1b). Nous avons utilisé ces domaines prédits, couplés à la structure CAT définie par Verrey et ses collègues [34], pour sélectionner l'extrémité C-terminale de AaCAT1 à utiliser pour le criblage à deux hybrides de levure. Nous avons également déterminé qu'AaCAT1 se localise probablement sur la membrane plasmique et les lysosomes à l'aide de l'outil de prédiction de la localisation des protéines, DeepLoc-1.0 [52] (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1c).

Notre criblage à deux hybrides de levure utilisant la queue C-terminale d'AaCAT1 comme appât (Fig. 1b) a donné 207 colonies avec le complément complet d'activation du gène rapporteur sur un milieu sélectif à haute stringence QDO (fichier supplémentaire 2: jeu de données). Des plasmides proies ont été isolés de ces colonies et séquencés. Après suppression des faux positifs évidents et probables sur la base de l'analyse de la séquence des plasmides proies et des localisations tissulaires et subcellulaires connues des protéines proies, 13 interactions protéiques probables sont restées (fichier supplémentaire 1 : tableau S2). Parmi ceux-ci, cinq interacteurs ont été détectés dans au moins deux colonies distinctes (Fig. 1c). L'activateur eIF2-alpha kinase, GCN1, était le plus intéressant d'entre eux, car nous avons identifié trois colonies distinctes dérivées de deux clones distincts contenant des plasmides codant pour des peptides en interaction à partir de l'extrémité C-terminale de GCN1 (Fig. 1c, d), et parce que GCN1 a déjà été démontré qu'il participe à la régulation de la traduction par le GAAC chez d'autres eucaryotes [7, 9, 10, 14, 53].

Nous avons confirmé l'interaction entre AaCAT1 et GCN1 en concevant un peptide marqué 6-His correspondant à la même séquence de 28 acides aminés de l'extrémité C-terminale AaCAT1 utilisée pour notre appât à deux hybrides de levure. La coloration au bleu de Coomassie a révélé la rétention d'une bande> 260 kDa dans la fraction d'élution des tests de pull-down réticulés et non réticulés (Fig. 1e). Le Western blot d'échantillons de test pull-down non réticulés avec un anticorps anti-GCN1 a confirmé la présence de GCN1 dans la fraction d'élution pull-down (Fig. 1f).

Les transcrits de GCN1 dans les organes des femmes adultes, détectés par qRT-PCR, étaient les plus élevés dans les organes associés à la digestion des repas sanguins et à la vitellogenèse. Les niveaux relatifs d'ARNm de GCN1 étaient significativement plus élevés dans les ovaires que dans les têtes, les thorax et les tubules de Malpighi (ovaires/têtes : ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,0033 ; ovaires/thorax : ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,0094 ; ovaires/tubules de Malpighi : ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,0212) (Fig. 2a). Les corps gras et l'intestin moyen, qui sont d'autres organes nécessaires à la vitellogenèse, ont exprimé l'ARNm de GCN1 à des niveaux non significativement différents de ceux des ovaires (ovaires/corps gras : ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,2028 ; ovaires/intestin moyen : ANOVA, F(5,12) = 6,391, P = 0,1877). L'analyse Western blot des organes femelles adultes a révélé que les niveaux de protéine GCN1 étaient les plus élevés dans les ovaires. Nous avons également détecté la protéine GCN1 dans le corps gras et les tubules de Malpighi, mais, fait intéressant, pas dans l'intestin moyen. Enfin, nous avons détecté de faibles niveaux de protéine GCN1 dans la tête et les thorax. Ce modèle d'expression correspond à celui de nombreux organes dans lesquels AaCAT1 a déjà été détecté [36], les principaux tissus responsables de la vitellogenèse contenant des niveaux détectables d'AaCAT1 et de GCN1. L'analyse in silico de la localisation subcellulaire de GCN1 à l'aide de DeepLoc-1.0 [52] montre que GCN1 se localise très probablement dans le cytosol, mais peut également se localiser dans le noyau (fichier supplémentaire 1 : figure S2a) et contient plusieurs séquences de localisation nucléaire putatives, comme prévu à l'aide du cNLS Outil Mapper [54] (Fichier supplémentaire 1 : Figure S2b, c).

GCN1 est exprimé dans les tissus associés à la reproduction et son activité de signalisation est réduite après le knockdown médié par l'ARNi. un profilage qRT-PCR de l'expression de GCN1 dans les tissus adultes (en haut) et un transfert Western de l'expression de la protéine GCN1 (en bas) ont révélé l'expression de GCN1 dans les ovaires, le corps gras et les tubules de Malpighi. Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post hoc HSD de Tukey a été utilisée pour déterminer les différences significatives (P <0, 05) dans l'expression du transcrit gcn1. Une aliquote de 15 µg de protéine de chaque échantillon a été chargée pour la détection par Western blot. b Western blot de l'expression de GCN1 après injection d'ARNdb. c Le pourcentage d'expression de GCN1 par rapport au traitement par ARNdb GFP montre une diminution similaire de l'expression de GCN1 à 3 et 5 jours après l'injection (PI), avec une augmentation de l'expression relative de GCN1 commençant à 7 jours PI. L'intensité des pixels des bandes GCN1 en 2b (293 kDa, flèche) a été normalisée à l'aide de l'intensité des pixels de la bande lumineuse d'environ 50 kDa (pointe de flèche), qui avait des intensités similaires dans tous les échantillons. Les protéines totales ont été extraites de pools de 10 moustiques entiers pour chaque échantillon (n = 1) et 15 µg de protéines de chaque échantillon ont été analysés. d Western blots représentatifs de phospho-eIF2α (p-eIF2α), eIF2α et actine de trois pools de cinq abdomens féminins (n ​​= 3), avec intestin moyen retiré, après injection d'ARNdb GCN1 ou d'ARNdb de protéine fluorescente verte (GFP). Les moustiques injectés ont été échantillonnés à différents moments après le repas de sang (PBM): 0 (à jeun), 6, 12 ou 24 h PBM. Une aliquote de 10 µg de protéines totales de chaque échantillon a été chargée. e Les intensités de pixels des bandes p-eIF2α des moustiques injectés par GCN1 et GFP dans le blot de 2d ont été normalisées à l'intensité des pixels des bandes eIF2α de 2d pour tracer le changement d'intensité de la bande p-eIF2α à différents moments PBM. Les lettres représentent des groupes de signification statistique (P < 0,05) tels que déterminés par une analyse avec une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc HSD de Tukey pour les différences significatives entre les groupes de traitement et les points temporels. FB, corps gras ; LUI, chef ; OV, ovaire ; MG, intestin moyen ; TH, thorax ; MT, tubule de Malpighi ; MW, moustique entier ; pour les autres termes, voir Abréviations

Pour déterminer un laps de temps optimal pour les manipulations d'ARNi, nous avons injecté à un petit nombre de moustiques femelles 1 µg d'ARNdb GCN1 ou d'ARNdb GFP et avons isolé la protéine totale de pools de 10 moustiques (n = 1) à 3-, 5- et 7- jours PI. Nous avons effectué des transferts Western avec un anticorps dirigé contre GCN1 de mammifère pour sonder l'expression de la protéine GCN1 dans tous les échantillons (Fig. 2b). Les transferts Western avec cet anticorps primaire ont montré une bande GCN1 à environ 290 kDa et une bande supplémentaire à environ 50 kDa avec une intensité constante dans tous les échantillons (voir Fichier supplémentaire 1 : Figure S4d). Nous avons utilisé la densitométrie de bande pour semi-quantifier les intensités de pixel des bandes GCN1 (293 kDa) et les avons normalisées à la bande de 50 kDa que nous avons utilisée comme contrôle de chargement quasi interne. Le pourcentage de réduction de l'intensité de la bande GCN1 des échantillons d'ARNi GCN1 par rapport aux échantillons d'ARNi GFP à chaque instant a été représenté graphiquement, et nous avons observé une réduction d'environ 60 % des niveaux de protéine GCN1 dans les échantillons PI de 3 et 5 jours (Fig. 2c).

Pour élucider le rôle de GCN1 dans Ae. aegypti vitellogenèse, nous avons conçu et synthétisé l'ARNdb anti-GCN1 pour renverser l'expression du gène GCN1. Étant donné qu'il a été démontré que GCN1 est impliqué dans la signalisation des nutriments et la réponse à la famine chez d'autres organismes [9, 10, 11, 12, 14, 15, 53], nous voulions comprendre si le renversement de GCN1 entraînerait une létalité rapide et serait préjudiciable au renversement futur. expériences sur Ae. moustiques aegypti. Pour évaluer la létalité du renversement de GCN1, nous avons injecté environ 200 moustiques femelles avec 1 µg d'ARNdb GCN1 (n = 199) ou 1 µg d'ARNdb GFP (n = 205) comme contrôle d'injection et mesuré le pourcentage de mortalité sur 5 jours PI. Les deux groupes, c'est-à-dire les groupes knockdown et GFP-témoin, avaient> 80% de survie à 5 jours PI (fichier supplémentaire 1: figure S3a). Les taux de survie des moustiques injectés d'ARNdb GCN1 n'étaient pas significativement différents de ceux des témoins injectés d'ARNdb GFP à tout moment mesuré (test du log-rank Mantel-Cox, χ2 = 0,02547, df = 1, P = 0,8732) (Fichier supplémentaire 1 : figure S3a).

On sait que GCN1 régule GCN2, qui à son tour phosphoryle eIF2α et régule la traduction des protéines chez la levure [12, 14]. Pour tester si les injections d'ARNdb de GCN1 ont conduit à une réduction fonctionnelle de l'activité de GCN1, nous avons effectué des transferts Western sur trois pools de protéines totales isolées de l'abdomen de cinq moustiques à différents moments PBM (n = 3 à tous les moments) avec l'intestin moyen retiré pour éviter le sang contamination (Fig. 2d ; Fichier complémentaire 1 : Fig. S4e–g). Nous avons observé une diminution significative de la phosphorylation de eIF2α dans les deux groupes de traitement à 6 h PBM par rapport aux moustiques non nourris dans chaque groupe (GCN1 non nourri-GCN1 6 h PBM : ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,0128 ; GFP non nourri- GFP 6 h PBM : ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,0183) (Fig. 2e). Cela indique que la voie GAAC est un interrupteur actif de détection des nutriments chez la femelle Ae. aegypti lors de la métabolisation d'un repas de sang au cours de la vitellogenèse.

Lors de la comparaison de la phosphorylation de l'eIF2α entre les groupes de traitement, nous avons observé une diminution des niveaux d'eIF2α phosphorylé (Fig. 2d, panneau du haut) chez les moustiques injectés avec l'ARNdb GCN1 par rapport aux moustiques injectés avec l'ARNdb GFP à tous les moments (Fig. 2e); cependant, cette diminution n'était significative à aucun moment mesuré (à vide : ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9732 ; PBM de 6 h : ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9340 ; 12 h PBM : ANOVA, F(7,16) = 5,562, P = 0,9890 ; ANOVA PBM 24 h, F(7,16) = 5,562, P = 0,9506). Les niveaux d'eIF2α total et d'actine, utilisés comme témoins de chargement, étaient similaires dans les deux traitements (Fig. 2d, panneaux du milieu et du bas), ce qui nous a donné l'assurance que la diminution de la phosphorylation de l'eIF2α que nous avons observée chez les moustiques injectés d'ARNdb de GCN1 était due à notre renversement. traitement.

Nous avons nourri des moustiques nourris au sang injectés à la fois avec l'ARNdb GCN1 et l'ARNdb GFP 5 jours PI, puis avons échantillonné des groupes de moustiques à différents moments PBM pour l'analyse qRT-PCR de l'expression vg. Nous avons observé une augmentation de 2000 fois de l'ARNm vg 24 h PBM par rapport à l'état non nourri chez les moustiques injectés de GFP (fichier supplémentaire 1 : figure S3b). Fait intéressant, nous n'avons pas observé de réduction de l'expression de vg chez les moustiques injectés de GCN1 par rapport aux moustiques injectés de GFP, car l'ARNm de vg a augmenté de près de 3800 fois chez les moustiques injectés d'ARNdb de GCN1 (fichier supplémentaire 1 : figure S3b). L'expression de l'ARNm vg n'était pas significativement différente à tout moment mesuré (sans alimentation : test t non apparié, t(4) = 1,299, P = 0,2637 ; PBM 6 h : test t non apparié, t(4) = 0,2851, P = 0,7897 ; PBM 12 h : test t non apparié, t(4) = 1,275, P = 0,2713 ; PBM 24 h : test t non apparié, t(4) = 0,1612, P = 0,8797).

Pour déterminer les effets de l'inactivation de GCN1 sur la fécondité des moustiques, nous avons injecté aux moustiques femelles de l'ARNdb GCN1 ou GFP, puis disséqué les ovaires de groupes de femelles non nourries (0 h PBM) et nourries au sang à 24, 48 et 72 h PBM (Fig. 3a). La longueur des ovaires a augmenté à un rythme plus rapide chez les moustiques injectés de GCN1 au cours des 48 premières heures PBM, les longueurs étant significativement différentes à 24 h PBM (24 h PBM : test t non apparié, t (18) = 2,333, P = 0,0314 ; PBM 48 h : test t non apparié, t(18) = 0,8753, P = 0,3930). Cependant, les ovaires de moustiques injectés de GCN1 ont cessé de croître de 48 à 72 h PBM, lorsqu'ils ont été dépassés en longueur par les ovaires de femelles injectées de GFP, bien que la différence ne soit pas significative (test t non apparié, t(18) = 1,982, P = 0,0629) (figure 3b). Les longueurs d'ovocytes n'étaient pas différentes à aucun moment mesuré (sans alimentation : test t non apparié, t(18) = 1,571, P = 0,1335 ; PBM 24 h : test t non apparié, t(18) = 1,339, P = 0,1972 ; 48 h PBM : test t non apparié, t(18) = 0,09389, P = 0,9262 ; 72 h PBM : test t non apparié, t(18) = 0,4433, P = 0,6628) (Fig. 3c).

L'inactivation de GCN1 affecte la fécondité des moustiques. a Ovaires représentatifs imagés à partir de moustiques injectés avec de l'ARNdb GCN1 ou de l'ARNdb GFP à des moments précis PBM. Barres d'échelle dans chaque image : 500 µm. b, c Les longueurs d'ovaire (b) et les longueurs de cinq ovocytes représentatifs (c) ont été mesurées à partir de 10 moustiques injectés d'ARNdb GCN1 (n = 10) ou 10 moustiques injectés d'ARNdb GFP (n = 10) échantillonnés à 0 h PBM (à jeun) , PBM 24 h, PBM 48 h ou PBM 72 h. Les données sont présentées sous la forme de la longueur moyenne des 10 paires d'ovaires (b) ou d'ovocytes (c) ± erreur standard de la moyenne. Des tests t appariés ont été utilisés pour déterminer la signification statistique des différences entre les longueurs d'ovaires et d'ovocytes injectés d'ARNdb GCN1 et injectés d'ARNdb GFP à chaque instant. d Nombre d'œufs de moustiques injectés d'ARNdb GFP (n = 18) et injectés d'ARNdb GCN1 (n = 23). Les femelles individuelles injectées d'ARNdb ont été nourries de sang 5 jours PI et séparées dans des chambres de ponte individuelles. Le papier d'oeuf avec les oeufs déposés a été collecté 96 h PBM et desséché pendant 48 h avant le comptage. Chaque point représente le nombre d'œufs pondus par un seul moustique. Les lignes et les moustaches représentent le nombre médian d'œufs ± l'intervalle interquartile (IQR). e Taux d'éclosion de 12 (n = 12) couvées sélectionnées au hasard parmi les moustiques injectés dans la partie c. Les lignes et les moustaches représentent le pourcentage médian d'œufs éclos par couvée ± IQR. La signification statistique (P < 0,05) des données sur le nombre d'œufs et le taux d'éclosion a été déterminée avec les tests U de Mann-Whitney à l'aide du logiciel GraphPad Prism 8

Nous avons mesuré la taille des couvées de moustiques injectés avec des moustiques d'ARNdb GCN1 (n = 23) et d'ARNdb GFP (n = 18). L'inactivation de GCN1 a provoqué une réduction significative (test U de Mann – Whitney, U (39) = 92,50, Z = − 3,01, P = 0,0021) de la taille de la couvée par rapport aux témoins injectés de GFP, avec une médiane de 63 œufs par couvée dans le Groupe de traitement GCN1 comparé à une médiane de 88,5 œufs par couvée dans le groupe témoin GFP (Fig. 3d). Nous avons également mesuré les taux d'éclosion de 12 couvées sélectionnées au hasard de moustiques témoins injectés par GCN1 knockdown et GFP dsRNA. Les couvées pondues par les moustiques renversés GCN1 avaient un pourcentage médian de taux d'éclosion de 53 % et les couvées témoins avaient un pourcentage médian de taux d'éclosion de 75 %. Cette différence n'était pas statistiquement significative (test U de Mann-Whitney, U (22) = 44, Z = - 1, 62, P = 0, 1135) (Fig. 3e).

Dans cette étude, nous avons identifié un nouvel ensemble de protéines de signalisation qui font probablement partie du capteur de nutriments dans le corps gras, les ovaires et d'autres tissus du moustique [6, 30, 31, 35, 36, 45, 55, 56]. Nous avons découvert GCN1 en tant que partenaire d'interaction putatif de l'extrémité C-terminale d'un CAT et montré que l'inactivation de GCN1 affecte la signalisation des nutriments induite par les acides aminés et la fécondité des moustiques.

Nous avons commencé notre étude en ré-annotant les cinq protéines CAT de moustique de la famille des gènes transporteurs d'acides aminés de type SLC7 [32, 34, 57]. La base de données de gènes NCBI contient deux entrées distinctes pour Ae. aegypti CAT2 et CAT3 (AaCAT2, AaCAT3), et aucune entrée pour Ae. aegypti CAT1 ou CAT5 (AaCAT1, AaCAT5). Notre analyse (Fig. 1a) prend en charge la ré-annotation de l'entrée du gène CAT2 (GeneID : 5575859) en tant que CAT1 et de l'entrée du gène CAT3 (GeneID : 5575110) en tant que CAT5. AaCAT1 et AaCAT3 se sont regroupés avec D. melanogaster Slif (Fig. 1a), indiquant que AaCAT1 et AaCAT3 représentent une expansion de la famille Slif CAT au cours de l'histoire évolutive d'Ae. aegypti. Dans des études antérieures, nous avons montré que ces deux protéines étroitement apparentées sont des transporteurs d'acides aminés mais avec des spécificités de substrat complètement différentes. Alors que AaCAT3 a une large spécificité de substrat et transporte non seulement les quatre types d'acides aminés cationiques, mais également plusieurs acides aminés non chargés [35], AaCAT1 est un transporteur spécifique à l'histidine unique qui fait partie du capteur de nutriments du corps gras [36]. Parce qu'il a été démontré que l'inactivation d'AaCAT1 interfère avec la signalisation des nutriments du corps gras, en la plaçant en amont dans la cible de la voie de signalisation de la rapamycine (TOR) [30], nous avons choisi l'extrémité C-terminale d'AaCAT1 comme appât pour identifier les protéines cytoplasmiques en interaction.

Notre criblage à deux hybrides de levure de l'extrémité C-terminale d'AaCAT1 a produit 33 occurrences de protéines que nous avons considérées comme des interacteurs plausibles d'AaCAT1. Beaucoup d'entre eux pourraient être de véritables interacteurs d'AaCAT1 et seront candidats à d'autres études. Dans l'ensemble, la collection de protéines à forte interaction que nous avons identifiée (Fig. 1c) suggère la possibilité qu'AaCAT1 fasse partie d'un complexe conçu pour gérer la distribution de charge associée au transport d'acides aminés chargés et pour réguler diverses réactions métaboliques.

GCN1 était le candidat le plus intéressant que nous ayons identifié, en raison de son implication dans la régulation de la synthèse des protéines lors de la privation d'acides aminés chez les eucaryotes [9, 10, 11, 12, 14, 15, 53, 58]. Nous avons validé cette interaction entre AaCAT1 et GCN1 en utilisant des pull-downs in vitro avec des appâts AaCAT1 marqués par His et des proies de lysat de protéines. Cela n'exclut pas la possibilité qu'une autre protéine puisse combler cette interaction. Pour confirmer pleinement qu'il s'agit d'une interaction directe, des pull-downs in vitro utilisant des appâts AaCAT1 purifiés et des proies GCN1 devront être effectués. Cependant, notre détection de cette interaction par plusieurs tests nous donne l'assurance qu'elle est susceptible de se produire in vivo, que l'interaction soit directe ou pontée. Chez la levure, GCN1 forme un complexe avec plusieurs protéines, y compris la kinase, GCN2, et ce complexe se lie aux ribosomes où GCN2 peut détecter et être activé par des ARNt non chargés pendant des conditions de famine d'acides aminés [12,13,14,15]. Une fois activé, GCN2 phosphoryle la sous-unité alpha du complexe eucaryote facteur d'initiation de la traduction-2 (eIF2α) [12,13,14,15,16], entraînant la régulation à la baisse de la traduction générale et la stimulation de la traduction d'un petit ensemble de gènes, dont le facteur de transcription ATF4 (general control nonderepressible 4 [GCN4] chez la levure), qui régulent le métabolisme des acides aminés [20, 21, 59]. De plus, cette voie de signalisation a été impliquée dans la régulation de l'activité de mTOR chez les eucaryotes [23, 26]. Des recherches antérieures ont démontré que la signalisation mTOR est centrale pendant la vitellogenèse des moustiques [6, 31, 45, 55], et il a été démontré que la disponibilité des acides aminés affecte l'activité de mTOR et S6K chez Ae. aegypti [30, 31, 32, 45].

Étant donné que la région d'interaction AaCAT1 se trouve à l'extrémité C-terminale de GCN1 et ne chevauche pas les sites d'interaction ribosomique ou GCN2 chez la levure [14, 60], nous proposons que GCN1 interagissant avec AaCAT1 puisse servir de site d'ancrage pour les ribosomes. Interagir de cette manière permettrait à GCN1 à la fois de détecter rapidement les changements dans l'état des acides aminés de la cellule et d'augmenter l'efficacité de la traduction de YPP en recrutant des ribosomes dans des zones à forte concentration d'acides aminés. Il est également possible que l'interaction avec GCN1 soit nécessaire pour l'activation d'AaCAT1 ou le maintien de la stabilité du transporteur pendant la vitellogenèse, mais nos données d'inactivation de GCN1 ne soutiennent pas cette notion. Cependant, cette possibilité ne peut être exclue sans d'autres analyses de l'activité AaCAT après l'inactivation de GCN1. L'interaction que nous avons observée entre AaCAT1 et GCN1 peut avoir lieu dans plusieurs emplacements subcellulaires. Premièrement, GCN1 et AaCAT1 peuvent interagir au niveau de la membrane plasmique de la cellule. Deuxièmement, GCN1 et AaCAT1 peuvent interagir au niveau des vésicules de sécrétion car AaCAT1 est transporté vers la membrane cellulaire. Enfin, GCN1 et AaCAT1 peuvent interagir au niveau des lysosomes. Cette localisation d'interaction est possible, car AaCAT1 devrait se localiser soit sur la membrane cellulaire, soit sur les lysosomes (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1), et les lysosomes sont connus pour servir de site de stockage d'acides aminés [61] et de plaque tournante pour les acides aminés. signalisation acide par la voie TOR [62, 63]. D'autres études sont nécessaires pour élucider quelles relations peuvent exister entre GCN1, mTOR et les lysosomes au cours de la vitellogenèse et où ces interactions ont lieu dans la cellule. Pour comprendre comment GCN1 peut se croiser avec la signalisation mTOR, une étude à deux hybrides de levure utilisant des fragments de protéine GCN1 comme appât peut identifier les interactions entre GCN1 et les protéines de la voie de signalisation mTOR. De plus, l'avènement de l'édition de gènes de la protéine 9 associée à la protéine 9 (CRISPR/Cas9) à répétition palindromique courte régulièrement espacée en grappes telles que la transduction ovarienne médiée par les récepteurs (REMOT Control), qui permet l'utilisation de CRISPR/Cas9 pour développer des gènes lignées en injectant des moustiques femelles adultes [64], rend possible la génération de lignées knock-out de protéines de la voie du signal GCN1 ou mTOR. Cela peut permettre la conception d'expériences dans un arrière-plan génétique nul de signalisation GCN1 ou mTOR qui peut élucider davantage comment GCN1 et la voie GAAC peuvent se croiser avec la signalisation mTOR pour réguler la vitellogenèse. L'édition basée sur CRISPR / Cas9 peut également tirer parti de la réparation dirigée par homologie pour insérer avec précision des marqueurs fluorescents dans les gènes de signalisation GCN1 ou mTOR, permettant l'utilisation de techniques fluorescentes, telles que le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET), pour identifier si GCN1 interagit directement avec mTOR ou d'autres protéines de signalisation mTOR dans l'Ae. corps adipeux aegypti ou d'autres tissus à différents moments avant et pendant la vitellogenèse.

La densitométrie par Western blot de eIF2α phosphorylé normalisé à eIF2α en tant que contrôle de chargement a montré une diminution significative de la phosphorylation de eIF2α 6 h PBM chez les moustiques injectés avec de l'ARNdb GCN1 ou de l'ARNdb GFP (Fig. 2d, e). Ce changement est à prévoir si la voie GAAC est impliquée dans la sensation nutritive lorsque les moustiques femelles passent d'un régime pauvre en acides aminés de saccharose (en laboratoire) ou de nectar (dans la nature) à un repas de sang à haute teneur en acides aminés. Nous interprétons ce résultat pour indiquer que la voie GAAC joue un rôle actif dans la médiation du commutateur métabolique pour produire des YPP au début de la vitellogenèse. Lors de l'analyse d'un effet de l'inactivation de GCN1 sur l'activité de la voie GAAC, nous avons observé une diminution de la phosphorylation de eIF2α chez les moustiques injectés d'ARNdb GCN1 par rapport aux moustiques injectés d'ARNdb GFP avant le repas de sang et au cours des premières 24 h PBM (Fig. 2d, e) . L'analyse statistique de cette diminution n'a pas révélé d'effet de choc significatif sur la phosphorylation de eIF2α. Il a été démontré que l'activité de la kinase GCN2 est régulée par la tige P ribosomique chez d'autres eucaryotes [65, 66], il est donc possible que la redondance fonctionnelle de l'activation de GCN2 par les tiges P du ribosome du moustique puisse expliquer pourquoi nous avons observé une réduction non significative de Phosphorylation de eIF2α après suppression de l'expression de GCN1.

Fait intéressant, alors que l'inactivation de GCN1 n'affectait pas l'expression de l'ARNm vg détecté par qRT-PCR (fichier supplémentaire 1 : Fig. S3b), nous avons observé des différences dans la fécondité des moustiques femelles injectés avec l'ARNdb GCN1 par rapport aux contrôles d'ARNdb GFP (Fig. 3). Nous avons déjà publié des données sur la fécondité et le taux d'éclosion en utilisant des tailles d'échantillons comparables à celles utilisées dans la présente étude [67]. Ainsi, bien que nous soyons convaincus que nos données représentent avec précision l'effet de l'inactivation de GCN1 sur la fécondité, des expériences futures conçues pour comprendre la précision rôle joué par GCN1 dans la fécondité des moustiques comprendra des échantillons de plus grande taille. L'inactivation de GCN1 ne devrait pas inhiber d'autres facteurs connus pour être nécessaires à la transcription du gène YPP, notamment la signalisation de la 20-hydroxyecdysone (20-E), la signalisation de l'hormone juvénile ou la signalisation du peptide analogue à l'insuline [31]. Nous proposons trois explications possibles pour expliquer comment l'inactivation de GCN1 peut affecter la taille de la couvée sans affecter la transcription du gène YPP dans les expériences que nous avons réalisées. Premièrement, ces résultats pourraient être dus à une redondance fonctionnelle dans l'activation de GCN2 par les protéines de la tige P ribosomique. Deuxièmement, ces résultats peuvent être causés par une traduction accrue des protéines chez les moustiques traités à l'ARNdb GCN1 avant le repas de sang, ce qui a épuisé les réserves d'acides aminés avant le repas de sang, entraînant une réduction de l'efficacité de la synthèse de YPP. Troisièmement, l'inactivation de GCN1 peut provoquer un recrutement désordonné des ribosomes au cours de la vitellogenèse, ce qui réduit l'efficacité de la synthèse de YPP. Les futures études métabolomiques et protéomiques et les études de purification des ribosomes chez les moustiques renversés par GCN1 fourniront un aperçu de l'un ou l'autre de ces mécanismes susceptibles de jouer un rôle dans le changement de fécondité induit par GCN1.

Notre analyse de la localisation de GCN1 a montré que GCN1 est exprimé à des niveaux plus élevés dans les tissus impliqués dans le traitement des nutriments des repas sanguins et de la vitellogenèse, en particulier les ovaires, le corps gras et l'intestin moyen. Fait intéressant, dans l'intestin moyen de moustiques femelles non nourris, nous avons détecté l'ARNm de GCN1 avec qRT-PCR, mais nous n'avons pas détecté la protéine GCN1 par western blot. Nous émettons l'hypothèse que les tissus de l'intestin moyen peuvent réguler l'expression de la protéine GCN1 d'une manière différente de celle d'autres organes métaboliquement importants, par exemple par régulation post-transcriptionnelle, car les cellules de l'intestin moyen ne stockent pas autant de nutriments que le corps gras et les ovaires et peuvent ne nécessiter que l'activité de GCN1 à points transitoires autour de l'alimentation du sang. Des études futures devraient être conçues pour déterminer si l'ARNm de GCN1 est séquestré ou ciblé par les microARN dans ce tissu. Notre observation de l'augmentation de l'expression de GCN1 détectée par qRT-PCR et Western blot dans les ovaires par rapport à d'autres tissus féminins adultes (Fig. 2a) indique que GCN1 joue un rôle important dans le métabolisme ovarien, qui devrait être étudié. Il est probable que GCN1 exerce une fonction similaire dans les ovaires et le corps gras, car les deux tissus subissent des changements métaboliques importants au cours de la vitellogenèse. Il se peut également que le GCN1 endogène dans les ovocytes serve à réguler le métabolisme des acides aminés au cours de l'embryogenèse. Récemment, GCN1 a été impliqué dans la régulation de la prolifération cellulaire de manière indépendante de GCN2 dans des cellules embryonnaires de souris établies à partir d'embryons mutants GCN1 [58]. Des études futures, y compris la détermination directe de l'effet knockdown de GCN1 sur des tissus spécifiques, devront être réalisées pour déterminer le rôle exact joué par l'interaction AaCAT1-GCN1 dans Ae. aegypti vitellogenèse.

L'identification des interacteurs d'AaCAT1 et leur implication dans les voies de signalisation cellulaire fournissent des informations importantes sur les voies de signalisation des nutriments. En identifiant les protéines impliquées dans ces voies, des cibles chimiques ou des inhibiteurs spécifiques des protéines identifiées peuvent être conçus. Notre analyse des interactions protéiques avec un seul des cinq Ae. aegypti CATs a révélé un lien entre AaCAT1 et une deuxième voie de capteur de nutriments qui n'avait pas de rôle précédemment établi dans Ae. signalisation des nutriments aegypti. Avec plus d'interactions CAT à étudier, associées à notre compréhension croissante de l'activité GCN1, notre image du système de capteurs de nutriments chez les moustiques ne fait que devenir plus complexe.

Les ensembles de données soutenant les conclusions de cet article sont disponibles dans l'article (et ses fichiers supplémentaires) et auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Aedes aegypti transporteur d'acides aminés cationiques 1, 2, 3, 5, respectivement

Réponse des acides aminés

Activation du facteur de transcription 4

Protéine 9 associée à CRISPR

Transporteur d'acides aminés cationiques

Transporteur d'acides aminés cationiques 1, 2, 4, 5, respectivement

ADN gratuit

Courte répétition palindromique regroupée régulièrement espacée

Double abandon (médias)

Diméthylsulfoxyde

Désoxyribonucléoside triphosphate

ARN double brin

Sulfoxyde de disuccinimidyle

Dithiothréitol

Acide Éthylène Diamine Tétra-Acétique

Sous-unité alpha du facteur 2 d'initiation de la traduction eucaryote

Transfert d'énergie de résonance de fluorescence

Contrôle général des acides aminés

Contrôle général non dérépressible 1, 2, 4, 20, respectivement

Protéine fluorescente verte

Transporteur d'acides aminés hétérodimériques

Octylphénoxy poly(éthylèneoxy)éthanol, ramifié

Analyse génétique évolutive moléculaire

ARN messager

Cible mécaniste de la rapamycine

Cible mécaniste du complexe de rapamycine 1

Il y a des millions d'années

Centre national d'information sur la biotechnologie

Non transcrit à l'envers

Désoxythymidine oligomérisée

Protéine ribosomale S6 kinase bêta-1

Post-repas de sang

Post-injection

Difluorure de polyvinylidène

Quadruple abandon (médias)

PCR de transcription inverse quantitative

Transduction ovarienne médiée par les récepteurs de la cargaison

Interférence ARN

Protéine ribosomique S7

Médias synthétiques définis

Électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium et de polyacrylamide

Famille de porteurs de solutés 7

Slimfast

Tampon tris-acétate EDTA

Solution saline tamponnée Tris

Solution saline tamponnée au Tris + 0,05 % de Tween-20

Cible de la rapamycine

ARN de transfert

Vitellogénine

Protéine précurseur du jaune

20-Hydroxyecdysone

6-Histidine

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Le réactif suivant a été fourni par le NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center pour distribution via BEI Resources, NIAID, NIH : Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool, Eggs, NR-48921. Le plasmide 3' EGFP pXOON a été fourni par le Dr Dmitri Boudko. Les auteurs remercient Carolyn Armendariz et Hailey Luker pour leur aide à l'élevage des moustiques, et Harley Bendzus-Mendoza pour son aide à l'analyse statistique.

Ce travail a été soutenu par les subventions # 5SC1GM125584 et # 1R35GM144049 du National Institute of Health, du programme de boursiers postdoctoraux du NMSU, du NMSU Howard Hughes Medical Institute et du programme de chercheurs de premier cycle de l'Alliance du Nouveau-Mexique pour les participants des minorités.

Département de biologie, Université d'État du Nouveau-Mexique, Las Cruces, NM, États-Unis

Matthew Pinch, Theodore Muka, Yashoda Kandel, Mahesh Lamsal, Nathan Martinez, Marialuisa Teixeira & Immo A. Hansen

ReCode Therapeutics, Dallas, Texas, États-Unis

Dmitri Y. Boudko

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MP a effectué des tests à deux hybrides sur levure, des tests pull-down, la qRT-PCR, la synthèse d'ARNdb, des knockdowns d'ARNi, des Western blots, des données analysées, des Figs. 1, 2, 3 et les tableaux 1, 2, 3, ont préparé des données supplémentaires et rédigé le manuscrit. TM a effectué des tests à deux hybrides sur levure, des tests pull-down, la synthèse d'ARNdb, des knockdowns d'ARNi, des données analysées, des Figs. 1 et 3, préparé des données supplémentaires et rédigé le manuscrit. YK a effectué des knockdowns ARNi, une imagerie ovarienne, analysé les données et préparé la Fig. 3. ML a effectué des Western blots et qRT-PCR. NM a effectué des Western blots. MT a effectué qRT-PCR. DYB a fourni des réactifs et généré des chiffres supplémentaires. IAH a contribué à la conception des expériences et a rédigé le manuscrit. Tous les auteurs lisent et approuvent le manuscrit final.

Correspondance à Immo A. Hansen.

N'est pas applicable.

N'est pas applicable.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Annotations de toutes les entrées CAT utilisées pour l'arborescence d'annotations CAT. Tableau S2. Interacteurs protéiques potentiels identifiés à partir du criblage à deux hybrides de levure AaCAT1. Figure S1. Aé. aegypti AaCAT1 est une protéine transmembranaire qui se localise sur la membrane plasmique. un. La structure tertiaire de la protéine AaCAT1 a été visualisée à l'aide de PyMOL (https://pymol.org/2/). b. L'outil de prédiction transmembranaire TMHMM, Krogh et al. [39] a été utilisé pour prédire les domaines transmembranaires et les régions intracellulaires et extracellulaires d'AaCAT1 afin de concevoir le fragment d'appât pour l'analyse à deux hybrides de levure. c. AaCAT1 devrait se localiser sur la membrane plasmique, comme déterminé par l'outil de localisation subcellulaire DeepLoc-1.0, Almagro Armenteros et al. [52]. Figure S2. Prédictions in silico de la localisation subcellulaire de GCN1. un. Il est prévu que GCN1 se localise dans le cytoplasme, mais peut également se localiser dans le noyau. b. Les séquences de localisation nucléaire prédites (NLS) trouvées dans GCN1 révèlent plusieurs NLS avec des scores indiquant un modèle de localisation mixte nucléaire-cytoplasmique. c. Résultat de la partie b montrant l'emplacement du NLS prédit dans le contexte de la séquence d'acides aminés GCN1. La prédiction de la localisation subcellulaire a été réalisée à l'aide de l'outil de localisation subcellulaire DeepLoc-1.0, Almagro Armenteros et al. [52]. La prédiction NLS a été réalisée à l'aide de l'outil de prédiction cNLS Mapper, Kosugi et al. [54]. Figure S3. L'inactivation de GCN1 n'est pas létale et n'affecte pas la transcription YPP. un. La survie des moustiques témoins injectés d'ARNdb GCN1 et injectés d'ARNdb GFP n'était pas significativement différente jusqu'à cinq jours après l'injection. Un test du log-rank de Mantel-Cox a été utilisé pour tester les différences significatives entre les deux traitements. b. Analyse qRT-PCR de la transcription vg chez les moustiques témoins injectés d'ARNdb GCN1 et injectés d'ARNdb GFP. Trois répliques biologiques ont été analysées par traitement à chaque instant et les niveaux d'ARNm de vg ont été normalisés par rapport à l'ARNm de β-actine avant de calculer le changement de pli dans l'expression de vg au cours des premières 24 heures de PBM. Des tests t appariés ont été utilisés pour tester les différences significatives entre les deux traitements à chaque instant. Figure S4. Images Western blot et bleu de Coomassie utilisées dans les figures principales sans recadrage, suppression de couleur et correction de luminosité/contraste. L'étiquette au-dessus de chaque image contient une référence à la figure de texte principale dans laquelle l'image est incluse.

: Jeu de données S1. Classeur Excel contenant toutes les séquences de proies à deux hybrides de levure provenant de colonies avec des copies de plasmide de proie unique. Chaque rangée représente le résultat d'une seule colonie et comprend la séquence d'inserts de proie générés à partir du promoteur T7 dans le plasmide de proie pGAD-T7.

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Réimpressions et autorisations

Pinch, M., Muka, T., Kandel, Y. et al. Le contrôle général non dérépressible 1 interagit avec le transporteur d'acides aminés cationiques 1 et affecte la fécondité d'Aedes aegypti. Vecteurs parasites 15, 383 (2022). https://doi.org/10.1186/s13071-022-05461-x

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Reçu : 23 mars 2022

Accepté : 27 août 2022

Publié: 21 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1186/s13071-022-05461-x

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