Effets de l'ordre d'exposition aux antimicrobiens sur l'incidence de la multidrogue

Nov 03, 2023

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8826 (2023) Citer cet article

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Pseudomonas aeruginosa multirésistant (MDRP) est l'un des agents pathogènes les plus importants en pratique clinique. Pour clarifier les mécanismes contribuant à son émergence, nous avons isolé des MDRP à l'aide de la P. aeruginosa PAO1, dont la séquence complète du génome a déjà été élucidée. Des souches mutantes résistantes aux carbapénèmes, aux aminoglycosides et aux nouvelles quinolones, utilisées pour traiter les infections à P. aeruginosa, ont été isolées ; cependant, aucun ne répondait aux critères des MDRP. Ensuite, les souches PAO1 ont été exposées à ces agents antimicrobiens dans divers ordres et le taux d'apparition de MDRP a varié selon l'ordre d'exposition ; Les MDRP apparaissaient plus fréquemment lorsque la gentamicine était appliquée avant la ciprofloxacine, mais étaient rarement isolées lorsque la ciprofloxacine était appliquée en premier. L'exposition à la ciprofloxacine suivie de gentamicine a augmenté l'expression de MexCD-OprJ, une pompe à efflux multidrogue de type RND, en raison de la mutation NfxB. En revanche, l'exposition à la gentamicine suivie de ciprofloxacine a entraîné davantage de mutations dans l'ADN gyrase. Ces résultats suggèrent que le type de mécanisme de résistance aux quinolones est lié à la fréquence des MDRP et que le risque d'incidence de MDRP dépend fortement de l'ordre d'exposition à la gentamicine et à la ciprofloxacine.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste qui présente une résistance intrinsèque élevée aux agents antimicrobiens. P. aeruginosa peut acquérir une résistance par l'utilisation inappropriée et/ou l'administration à long terme d'agents antimicrobiens. De nombreuses souches de P. aeruginosa multirésistantes (MDRP) ont été identifiées et sont hautement résistantes à trois agents antimicrobiens, à savoir les β-lactamines à large spectre, les aminoglycosides et les fluoroquinolones1,2,3. Étant donné que le nombre d'antibiotiques efficaces contre la MDRP est limité, les contre-mesures sont importantes.

Pour favoriser l'utilisation appropriée des agents antimicrobiens, il est important de clarifier la relation entre les agents antimicrobiens utilisés et les mécanismes sous-jacents à l'acquisition de la résistance. Les analyses d'isolats cliniques ont progressé ces dernières années, aboutissant à une compréhension plus détaillée des MDRP1,2,3. Cependant, il est impossible de trouver la souche parentale d'une MDRP isolée en milieu clinique car une fois la MDRP isolée, la souche parentale sensible a déjà disparu. Par conséquent, les analyses de MDRP isolés cliniquement ne peuvent à elles seules révéler une relation directe entre le type d'antimicrobien utilisé dans le traitement et le mécanisme sous-jacent à l'acquisition d'une résistance à celui-ci.

Dans la présente étude, nous avons isolé et analysé des MDRP à l'aide de la souche P. aeruginosa PAO1, dont la totalité de la séquence d'ADN génomique est disponible. Nous n'avons pas pu isoler les MDRP avec une exposition à un ou deux agents antimicrobiens, mais nous avons réussi avec une exposition séquentielle à trois agents antimicrobiens. Par conséquent, les MDRP ont émergé en empilant plusieurs mécanismes de résistance. Nous avons également constaté que l'ordre dans lequel les antimicrobiens sont utilisés peut affecter l'émergence des MDRP.

Nous avons isolé des mutants résistants aux médicaments de P. aeruginosa PAO1 pour la carbénicilline (β-lactamines), l'imipénème (carbapénèmes), la gentamicine et l'amikacine (aminosides), et la ciprofloxacine et la lévofloxacine (fluoroquinolones), qui sont utilisées pour traiter l'infection à P. aeruginosa en clinique. paramètres. La fréquence d'apparition des mutants résistants était de 7,5.10-7 à 1,1.10-8 (Tableau 1).

Parmi 540 mutants, le spectre de résistance aux antibiotiques a été étudié chez 92 mutants sélectionnés au hasard. Ces mutants ont été classés en sept groupes par le spectre (tableau 2). Soixante-huit mutants présentaient une multirésistance (groupes 1 à 3). Dans ces groupes, le spectre de résistance aux médicaments était identique ou similaire au modèle de substrat des pompes à efflux de type RND4,5,6,7. Chez certains mutants de chaque groupe, l'expression de gènes de pompe à efflux de type RND a été étudiée par RT-PCR. L'expression de mexA était régulée positivement dans les mutants du groupe 1 (Fig. 1A). L'expression de mexC a été observée dans les mutants du groupe 2, mais n'a pas été détectée dans PAO1 (Fig. 1B). L'expression de mexX était régulée positivement dans les groupes 3 et 4 (Fig. 1C). Étant donné que les souches mutantes classées dans le groupe 5 n'étaient résistantes qu'à la carbénicilline, on suppose que la β-lactamase AmpC est fortement exprimée dans ces souches8. Dans le groupe 6, seule la résistance à l'imipénème a été observée et l'expression régulée à la baisse de la porine de membrane externe OprD a été spéculée9,10. Les mutants du groupe 7 ont montré une résistance à la ciprofloxacine et à la lévofloxacine, indiquant une mutation de l'ADN gyrase ou de la topoisomérase IV11. Outre les mutants de l'imipénème, la majorité des mutants présentaient une résistance multidrogue, suggérant l'expression régulée à la hausse des pompes d'efflux multidrogues. Cependant, aucun mutant considéré comme MDRP (CMI pour l'imipénème : 16 μg/ml ou plus, amikacine : 32 μg/ml ou plus, ciprofloxacine : 4 μg/ml ou plus) n'a été isolé par cette procédure.

Expression de gènes de pompe à efflux multidrogues de type RND. (A) panneau supérieur : mexA, panneau inférieur : rpsL (contrôle interne), M : marqueur (pUC19/MspI), 1 : PAO1, 2 : CAR204, 3 : CAR401, 4 : LV201, 5 : LV206, 6 : LV438. (B) Panneau supérieur : mexC, Panneau inférieur : rpsL (contrôle interne), M : marqueur (pUC19/MspI), 1 : PAO1, 2 : CIP101, 3 : CIP126, 4 : IC4430, 5 : IC4404, 6 : LV235, 7 : LV801. (C) Panneau supérieur : mexX, panneau inférieur : rpsL (contrôle interne), M : marqueur (pUC19/MspI), 1 : PAO1, 2 : AMK1606, 3 : AMK1612, 4 : GM458. (D) Panneau supérieur : mexX, panneau inférieur : rpsL (contrôle interne), M : marqueur (pUC19/MspI), 1 : PAO1, 2 : GM458, 3 : IG4455, 4 : CG4401, 5 : CG4411, 6 : CgG4479, 7 : ICG444391, 8 : ICG444242, 9 : CIG44408. (E) Panneau supérieur : mexX, panneau inférieur : rpsL (contrôle interne), M : marqueur (pUC19/MspI), 1 : PAO1, 2 : CgIG44441. La ligne pointillée blanche indiquait une section coupée d'une photographie d'électrophorèse. Les données brutes ont été présentées dans les données supplémentaires.

Étant donné que la fréquence d'isolement d'un antibiotique variait entre 10–7 et 10–8, des difficultés étaient associées à l'isolement direct des MDRP de PAO1 après exposition à un médicament. Par conséquent, nous avons supposé que les MDRP pouvaient être isolées par une exposition séquentielle à trois médicaments.

Étant donné que les MDRP n'ont pas été isolées par une exposition à un seul médicament, nous avons tenté d'isoler les MDRP par une exposition séquentielle à trois médicaments différents (Fig. 2). IPM429, GM458, CIP101, CIP126 et CIP131 ont été utilisés comme mutants après la première exposition. Le mutant IPM429 a montré une augmentation de la CMI pour l'imipénem et la protéine porine OprD n'a pas été détectée (tableau 3, figure 3). Étant donné que certains mutants résistants à la gentamicine présentent un phénotype de résistance instable, d'autres analyses ont été effectuées en utilisant des mutants GM458 présentant une résistance stable à la gentamicine. GM458 a montré une augmentation de la CMI pour la gentamicine, l'amikacine, la ciprofloxacine et la lévofloxacine (tableau 3) ainsi que l'expression régulée à la hausse de mexX, un composant du transporteur d'efflux multidrogue de type RND MexXY-OprM (Fig. 1C). Deux types de mutants résistants à la ciprofloxacine ont été obtenus : l'un (CIP131) a montré une augmentation de la CMI pour les fluoroquinolones (ciprofloxacine et lévofloxacine) uniquement en raison d'une mutation dans GyrA, une sous-unité de l'ADN gyrase (tableau 3, 5). Les autres (CIP101 et CIP126) ont montré une résistance non seulement aux fluoroquinolones, mais aussi aux tétracyclines, au chloramphénicol, à l'érythromycine et à l'acriflavine. Il a été précédemment signalé que ces médicaments étaient exportés via le transporteur d'efflux multidrogue de type RND MexCD-OprJ4, 12, et l'expression régulée à la hausse de mexCD-oprJ a été observée (Fig. 1B). Les deux types de mutants CIP ont été utilisés comme souche parentale dans l'étape suivante. Les mutants ont été exposés à huit séquences de médicaments différentes.

Flux d'acquisition de mutants. En utilisant PAO1 comme souche parentale, des mutants résistants de la gentamicine, de l'imipénème et de la ciprofloxacine ont été initialement obtenus. Une souche représentative a été sélectionnée parmi elles et exposée au deuxième agent antimicrobien pour obtenir une souche mutante résistante. De la même manière, le troisième agent antimicrobien a été exposé pour obtenir trois mutants résistants aux médicaments.

Analyse Western blot d'OprD. 1 : PAO1, 2 : IPM429, 3 : GI4401, 4 : CI4401, 5 : CgI4401, 6 : GCI48410, 7 : CGI44201, 8 : CgGI44405. Après traitement par chimiluminescence, les transferts ont été visualisés avec un système d'imagerie sur gel. Seules les voies obligatoires sont indiquées ici. Les données brutes avant le rognage ont été présentées dans les données supplémentaires.

Des mutants GI ont été isolés à partir de GM458 exposés à 4 μg/mL d'imipénème. Cinq mutants ont montré une augmentation de la CMI pour l'imipénème uniquement (de 8 à 32 fois) (tableaux 3 et S1). Dans le GI4401 représentatif, la protéine OprD n'a pas été détectée dans la fraction membranaire (Fig. 3). Dans cette souche, une délétion d'un nucléotide a été observée dans la région codante oprD, conduisant à une mutation par décalage de cadre (tableau 4). Des mutants résistants à la ciprofloxacine ont été isolés à partir de GI4401 exposés à 2 μg/ml de ciprofloxacine. La CMI pour la ciprofloxacine et la lévofloxacine a augmenté chez dix mutants sélectionnés au hasard (4 à 16 et 8 à 16 fois, respectivement) (tableaux 3 et S1). Les dix mutants satisfaisaient aux critères du MDRP. À l'exception de GIC44805, des mutations dans la région déterminant la résistance aux quinolones (QRDR) de gyrA ou gyrB ont été identifiées. (Tableau 5).

Nous avons isolé des mutants résistants à la ciprofloxacine (mutants GC) de GM458 exposés à 2 μg/ml de ciprofloxacine. Dix des mutants ont montré une augmentation de la CMI pour la ciprofloxacine et la lévofloxacine, mais pas pour les autres médicaments (tableaux 3 et S2). Ce résultat indiquait que ces mutants étaient des mutants d'ADN gyrase, mais pas des mutants régulés à la hausse MexCD-OprJ. Tous les mutants avaient une mutation dans le QRDR de gyrA (tableau 5). Des mutants résistants à l'imipénem (mutants GCI) ont été isolés à partir de GC4801 exposés à 4 μg/mL d'imipénem. Les dix mutants GCI ont tous présenté une résistance accrue à l'imipénem (augmentation de 16 à 32 fois comme GC4801) (tableau 3). Dans GCI48410, une mutation d'insertion a été observée dans oprD, entraînant une mutation de décalage de cadre (tableau 4), et la protéine OprD n'a pas été détectée dans la fraction de membrane externe (Fig. 3). Les dix mutants GCI satisfaisaient aux critères de la MDRP (tableau S2).

Des mutants résistants à la ciprofloxacine (mutants IC) ont été isolés par exposition d'IPM429 à 1 μg/ml de ciprofloxacine. Dix mutants IC ont montré une augmentation de la CMI non seulement pour les fluoroquinolones, mais également pour le chloramphénicol, l'érythromycine et l'acriflavine (tableaux 3 et S3). La régulation à la hausse de mexCD-oprJ semble s'être produite. Chez six des dix mutants, la CMI pour la carbénicilline, l'imipénem, ​​la gentamicine et l'amikacine a été diminuée (tableau S3). Un phénomène similaire a été rapporté pour le mutant nfxB13,14. Le niveau d'ARNm de mexC a augmenté dans IC4430, alors que les CMI de la carbénicilline, de l'imipénème, de la gentamicine et de l'amikacine sont restées inchangées. Dans IC4404, les CMI pour la carbénicilline, l'imipénem, ​​la gentamicine et l'amikacine ont été diminuées (Fig. 1B). En utilisant IC4430, des mutants résistants à la gentamicine (mutants ICG) ont été isolés par une exposition à 16 μg/ml de gentamicine. Les dix mutants ICG ont tous montré une augmentation significative de la CMI pour la gentamicine et l'amikacine, tandis que neuf ont montré une diminution de la CMI pour l'imipénem, ​​la ciprofloxacine, la lévofloxacine, la tétracycline, le chloramphénicol et l'érythromycine (tableaux 3 et S3). Dans ICG444391, qui maintenait la CMI pour l'imipénème, la ciprofloxacine, la lévofloxacine, la tétracycline, le chloramphénicol et l'érythromycine, mexX était fortement exprimé dans ICG444391 (Fig. 1D). Seul ICG444391 répondait aux critères du MDRP.

Des mutants résistants à la gentamicine (mutants IG) ont été isolés à partir d'IPM429 exposés à 16 μg/ml de gentamicine. Dix mutants ont montré une résistance accrue à la gentamicine et à l'amikacine (8 à 16 fois et 4 à 8 fois, respectivement) (tableaux 3 et S4). Ces modèles de résistance aux médicaments ont indiqué l'expression régulée à la hausse de mexXY; cependant, trois mutants (IG4405, IG4427 et IG4485) se sont avérés revenir facilement aux niveaux d'expression de la souche parentale avec une sous-culture en bouillon sans antibiotiques. Nous avons sélectionné IG4455 montrant une résistance stable pour des analyses ultérieures. Dans IG4455, l'expression de mexX était régulée à la hausse (Fig. 1D). Des mutants résistants à la ciprofloxacine (mutants IGC) ont été isolés à partir d'IG4455 exposés à 2 μg/ml de ciprofloxacine. Dix mutants ont présenté une résistance accrue à la ciprofloxacine et à la lévofloxacine (tableau S4), et la mutation GyrB a été identifiée dans le QRDR (Ser466Phe) de tous les mutants (tableau 5).

L'expression régulée à la hausse de mexC a été observée dans CIP101 (Fig. 1B). Des mutants résistants à la gentamicine (mutants CG) ont été isolés suite à une exposition à 16 µg/ml de gentamicine. Dix mutants ont montré une augmentation de la CMI pour la gentamicine et l'amikacine (de 8 à 64 fois) (tableaux 3 et S5). Dans CG4401, l'expression de mexX était régulée à la hausse (Fig. 1D). Des mutants résistants à l'imipénème (mutants CGI) ont été isolés de CG4401 avec 2 μg / ml d'imipénème, et dix mutants ont montré une augmentation de la CMI pour l'imipénème uniquement (8 à 16 fois) (tableaux 3 et S5). La protéine OprD n'a pas été détectée dans la fraction membranaire de CGI44201 (Fig. 3). Une importante délétion a été identifiée dans la région codante oprD (tableau 4). Les dix mutants CGI ont été définis comme non MDRP car la CMI pour l'imipénème était inférieure à 16 μg/ml.

Nous avons tenté d'isoler des mutants résistants à l'imipénème (mutants CI) de CIP101 exposés à 2 μg/ml d'imipénème, mais sans succès pour des raisons inconnues. Cependant, des mutants CI ont été isolés de CIP126, un mutant avec l'expression régulée à la hausse de mexC, exposé à 4 μg/ml d'imipenem. Les dix mutants CI ont montré une CMI 16 fois plus élevée pour l'imipénème (tableaux 3 et S6). La protéine OprD n'a pas été détectée dans la fraction membranaire de CI4401 (Fig. 3) et une mutation non-sens a été identifiée dans la région codante d'oprD (Tableau 4). Les mutants résistants à la gentamicine (mutants CIG) de CI4401 isolés avec 16 μg/ml de gentamicine ont montré une résistance accrue à la gentamicine et à l'amikacine (tableaux 3 et S6). L'un de ces mutants, CIG44408, a montré l'expression régulée à la hausse de mexX (Fig. 1E). Trois des dix mutants CIG (CIG44402, CIG44404 et CIG44408) ont été classés comme MDRP.

CIP131 présentait une résistance accrue à la ciprofloxacine et à la lévofloxacine, ce qui indiquait qu'il s'agissait d'un mutant de l'ADN gyrase. Nous avons identifié une mutation ponctuelle (Thr83Ile) dans le QRDR de GyrA (Tableau 5). En utilisant 16 μg/ml de gentamicine, nous avons isolé des mutants résistants à la gentamicine (mutants CgG). Neuf mutants CgG ont montré une CMI plus élevée que CIP131 pour la gentamicine, l'amikacine, la ciprofloxacine et la lévofloxacine (tableaux 3 et S7). L'expression régulée à la hausse de mexX a été observée dans CgG4479 (Fig. 1D). Des mutants résistants à l'imipénème (mutants CgGI) ont été isolés à partir de CgG4479 exposés à 4 μg/ml d'imipénème. Les dix mutants CgGI ont montré une CMI de 8 à 16 fois plus élevée pour l'imipénème uniquement (tableaux 3 et S7). Cinq des dix mutants ont été reconnus comme MDRP. Une délétion de nucléotide dans oprD, entraînant une mutation par décalage de cadre, a été identifiée dans CgGI44405 (tableau 4), tandis que la protéine OprD n'a pas été détectée dans la fraction de membrane externe (figure 3).

Des mutants résistants à l'imipénème (mutants CgI) de CIP131 ont été isolés avec 4 μg/ml d'imipénème. Les dix mutants CgI ont montré une résistance accrue à l'imipénem uniquement (tableaux 3 et S8), et une délétion d'un nucléotide (et une mutation par décalage de cadre) a été identifiée dans oprD dans CgI4401 (tableau 4). La protéine OprD n'a pas été détectée par une analyse par immunotransfert (Fig. 3). Des mutants résistants à la gentamicine (mutants CgIG) ont été isolés avec 16 μg/ml de gentamicine. Ces mutants ont montré une augmentation de la CMI pour la gentamicine, l'amikacine, la ciprofloxacine et la lévofloxacine (tableaux 3 et S8). Une expression plus élevée de mexX a été observée dans CgIG44441 (Fig. 1D). Huit mutants ont été classés comme MDRP.

Nous avons considéré le taux d'apparition de MDRP selon la CMI pour la ciprofloxacine, la gentamicine et l'imipénème. Dans le cas des mutants GCI, GIC et IGC, tous les mutants ont été classés comme MDRP. Cinq mutants CgGI sur dix ont montré une CMI de 8 μg/ml pour l'imipénem, ​​tandis que les cinq autres ont montré 16 μg/ml. Comme cette différence n'était que de deux fois, elle a été considérée comme négligeable. L'ordre séquentiel de GCI, GIC, IGC et CgGI a augmenté le taux d'apparition de MDRP.

Les MDRP n'étaient pas inclus dans les mutants CGI. Parmi les mutants ICG, CIG et CgIG, certaines souches étaient des MDRP. Cependant, de nombreux MDRP ont présenté une résistance instable à la gentamicine. Un et trois MDRP ont été initialement inclus dans les mutants ICG et CIG, respectivement ; cependant, la résistance à la gentamicine a disparu après la sous-culture. Dans CgIG, bien que huit isolats aient initialement montré le phénotype MDRP, sept étaient des MDRP instables.

Nous avons tenté ici de clarifier les mécanismes contribuant à l'émergence des MDRP. Comme prévu, nous n'avons pas été en mesure d'isoler les MDRP suite à une exposition à un seul médicament. Nous n'avons pas non plus isolé de MDRP suite à une exposition simultanée à trois médicaments, jusqu'à présent. Si la fréquence d'apparition des mutants pour chaque médicament est de 10-8, la fréquence de triple résistance sera de 10-24. Cette probabilité n'est pas nulle, mais est presque impossible à atteindre en laboratoire ou en milieu clinique. D'autre part, les MDRP ont été obtenus après une exposition séquentielle à chaque médicament. Comme l'ont rapporté de nombreux cliniciens et pharmaciens, l'utilisation séquentielle de différents types de médicaments a favorisé l'émergence de MDRP à risque plus élevé.

L'ordre d'exposition aux médicaments a affecté l'émergence des MDRP. Une exposition à la gentamicine avant la ciprofloxacine a entraîné un taux d'apparition plus élevé de MDRP. Ce résultat indique que les mécanismes sous-jacents à la résistance à la ciprofloxacine sont liés au taux d'apparition de MDRP. Après l'exposition initiale à la ciprofloxacine, les CMI du chloramphénicol, de l'érythromycine et de l'acriflavine, ainsi que de la ciprofloxacine et de la lévofloxacine, ont augmenté. Ces modèles de résistance étaient compatibles avec les substrats de transport pour MexCD-OprJ. Comme l'a révélé la RT-PCR (Fig. 1B), l'expression de mexC a augmenté de manière significative dans CIP126. Un phénomène similaire a été observé pour les mutants IC de IPM429. Ces résultats ont indiqué des augmentations de l'expression de mexC dans les cellules exposées à la ciprofloxacine avant l'expression régulée à la hausse de mexXY. D'autre part, l'expression de mexXY était déjà régulée positivement dans les cellules traitées à la ciprofloxacine exposées à la gentamicine, et une mutation de l'ADN gyrase a été détectée chez tous les mutants (mutants GC, IGC et GIC). Par conséquent, l'ordre d'exposition aux agents antimicrobiens peut affecter le mécanisme de résistance, à savoir une mutation de la gyrase ou l'expression plus élevée de mexCD-oprJ, avec des MDRP stables émergeant avec des ordres spécifiques.

Plusieurs mécanismes de résistance aux aminoglycosides chez P. aeruginosa ont été rapportés à ce jour, tels que l'inactivation par des enzymes modificatrices, des mutations dans les ribosomes et l'hyperexpression de mexXY15. De nombreux mutants ont montré l'hyperexpression de mexXY dans la présente étude. De plus, des mutations liées à l'hyperexpression de mexXY ont été rapportées7,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Bien que nous n'ayons pas encore identifié les changements de nucléotides pour la résistance à la gentamicine chez nos mutants, ils peuvent fournir des informations importantes sur la fréquence des MDRP.

Des mutants instables résistants à la gentamicine ont également été isolés à une certaine fréquence à chaque étape de l'isolement des mutants de la gentamicine. Il peut s'agir d'un type de « résistance adaptative »27. Dans nos expériences, des mutants stables de la gentamicine ont été sélectionnés pour la 2e ou la 3e étape. Très peu de mutants stables de la gentamicine ont été isolés lors de la 3ème étape ; par conséquent, la stabilité de la résistance à la gentamicine peut également être un facteur clé contribuant à l'incidence des MDRP.

L'acquisition de gènes exogènes peut être importante en tant que mécanisme pour l'émergence de MDRP sur les sites cliniques. L'enzyme de modification pour la résistance à la gentamicine et la métallo β-lactamase pour la résistance à l'imipénème doivent être prises en compte. Étant donné que l'acquisition de gènes exogènes ne peut pas se produire en laboratoire, les présents résultats peuvent ne pas refléter directement les mécanismes sous-jacents à l'émergence de la MDRP en milieu clinique. Cependant, les résultats obtenus indiquent que les facteurs de risque d'apparition de MDRP sont (1) une résistance stable à la gentamicine et (2) une exposition à la gentamicine avant la ciprofloxacine. Si la ciprofloxacine est prescrite pour traiter des infections avec des souches qui ont développé une résistance stable à la gentamicine en incorporant des gènes exogènes de résistance à la gentamicine, la fréquence de MDRP peut augmenter considérablement. Révéler la prévalence des gènes exogènes de résistance à la gentamicine en milieu clinique peut fournir une image complète de l'émergence de la MDRP.

Nous avons montré que le taux d'apparition des MDRP variait selon l'ordre d'exposition ; Les MDRP apparaissaient plus fréquemment lorsque la gentamicine était appliquée avant la ciprofloxacine, mais étaient rarement isolées lorsque la ciprofloxacine était appliquée en premier. Et l'exposition à la ciprofloxacine suivie de gentamicine a augmenté l'expression de MexCD-OprJ, une pompe à efflux multidrogue de type RND, en raison de la mutation NfxB. En revanche, l'exposition à la gentamicine suivie de ciprofloxacine a entraîné davantage de mutations dans l'ADN gyrase. Ces résultats suggèrent que le type de mécanisme de résistance aux quinolones est lié à la fréquence des MDRP et que le risque d'incidence de MDRP dépend fortement de l'ordre d'exposition à la gentamicine et à la ciprofloxacine.

Des cellules de P. aeruginosa PAO1 ou des mutants (107 à 109 UFC) ont été cultivées dans du milieu L (1,0 % de polypeptone, 0,5 % d'extrait de levure et 0,5 % de NaCl, pH 7,0) et étalées sur des plaques de gélose L (1,0 % de polypeptone, 0,5 % extrait de levure, 0,5 % de NaCl et 1,5 % de gélose, pH 7,0) contenant 1 × , 2 × , 4 × CMI pour l'un des sept agents antimicrobiens suivants : carbénicilline, imipénème, amikacine, gentamicine, ciprofloxacine, lévofloxacine et érythromycine. Nous avons obtenu de nombreuses colonies qui sont apparues sur les plaques après une incubation à 37°C pendant 24–36h. Après isolement d'une seule colonie, les profils de résistance aux médicaments des mutants ont été étudiés. Amikacine (Wako, cat. 014-24941), carbénicilline (Wako, cat. 037-23693), ciprofloxacine (Wako, cat. 032-18731), gentamicine (Wako, cat. 079-02973), imipénème (Wako, cat. 098-07283), la lévofloxacine (Fluka, cat. 28266) ont été achetées auprès des fabricants indiqués.

Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de divers médicaments ont été évaluées dans le bouillon Muller-Hinton (Difco) par la méthode de dilution au 1/2 selon les recommandations du CLSI (CLSI, 2006). Les cellules du milieu de test (105 cellules ml-1) ont été incubées à 37 ° C pendant 24 h, puis la croissance a été mesurée.

Les préparations d'ARN et la PCR transcriptionnelle inverse ont été réalisées selon les protocoles du fabricant. En bref, l'ARN bactérien total a été isolé à partir de cellules cultivées jusqu'à une DO650 de 0,7 à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen). L'ADN résiduel a été éliminé par le traitement avec la RNase-Free DNase (Promega). Un nanogramme d'ARN traité à la DNase a été utilisé comme matrice pour une réaction à l'aide du kit Qiagen OneStep RT-PCR (Qiagen). Les paires d'amorces pour détecter l'ARNm sont répertoriées dans le tableau S9. L'expression du gène rpsL a été utilisée comme contrôle interne. Les cycles de PCR étaient de 27 pour mexA, 33 pour mexC, 32 pour mexX et 24 pour rpsL. Les produits ont été séparés en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose à 3 % (Nippongene) et visualisés avec du bromure d'éthidium.

La préparation d'OprD a été réalisée par la méthode décrite précédemment avec une légère modification28. Les cellules de P. aeruginosa ont été cultivées jusqu'à la phase médiane (OD650 = 0,7), récoltées et mises en suspension dans du Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) + MgSO4 5 mM. Les cellules ont été cassées avec le sonicateur Vibra cell VC505. Les cellules intactes ont été retirées, la fraction membranaire a été préparée par ultracentrifugation (100 000 × g). Le culot a été lavé deux fois et dissous avec le même tampon. L'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide a été réalisée comme décrit précédemment29, 40 μg par échantillon. Les protéines ont été transférées sur un filtre à membrane de nitrocellulose (ADVANTEC Toyo). Un anticorps de lapin anti-OprD a été gracieusement fourni par Meiji Seika Pharma Co.30. Un anticorps IgG anti-lapin de chèvre (Bioss Inc, cat. bs-0295G-HRP) a été utilisé comme 2ème anticorps, et OprD a été détecté en utilisant le système ECL (Amersham Pharmacia Biotech).

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Nous tenons à remercier Meiji Seika Pharma Co., Ltd. pour avoir aimablement fourni l'anticorps anti-OprD de lapin. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number JP16390131.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Nami Yasuda et Tomoko Fujita.

Département de microbiologie, École supérieure de médecine, de dentisterie et de sciences pharmaceutiques, Université d'Okayama, 1-1-1, Tsushima-Naka, Kita-ku, Okayama, 700-8530, Japon

Nami Yasuda, Tomoko Fujita, Takahiro Fujioka, Mei Tagawa, Naoki Kohira, Daichi Morita, Wakano Ogawa, Tomofusa Tsuchiya & Teruo Kuroda

Département de microbiologie, École supérieure des sciences biomédicales et de la santé, Université d'Hiroshima, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8553, Japon

Kensho Torimaru, Takanori Kumagai, Daichi Morita et Teruo Kuroda

Département de biologie moléculaire, École de pharmacie, Université Shujitsu, 1-6-1 Nishigawara, Naka-ku, Okayama, 703-8516, Japon

Sumiko Shiota

Département de microbiologie et de biochimie, Université de pharmacie de Daiichi, 22-1, Tamagawa-Machi, Minami-ku, Fukuoka, 815-8511, Japon

Wakano Ogawa

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WO, TT et TK ont planifié ce projet. DM et TK ont rédigé le manuscrit principal. NY, TF, TF et NK ont isolé des mutants et effectué le test de sensibilité aux médicaments et la RT-PCR. NY et DM ont effectué l'analyse Western blot. TF, MT et KT ont identifié des sites de mutation. NY, TF, TF et TK ont préparé des figures et des tableaux. WO, SS, TK et DM ont eu des discussions critiques avec TK Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Teruo Kuroda.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Yasuda, N., Fujita, T., Fujioka, T. et al. Effets de l'ordre d'exposition aux antimicrobiens sur l'incidence de Pseudomonas aeruginosa multirésistant. Sci Rep 13, 8826 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35256-8

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Reçu : 24 juin 2022

Accepté : 15 mai 2023

Publié: 31 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35256-8

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