Activation de l'urotensine

May 30, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 511 (2023) Citer cet article

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Le remdesivir est un médicament antiviral utilisé pour le traitement du COVID-19 dans le monde entier. Des effets secondaires cardiovasculaires ont été associés au remdesivir ; cependant, le mécanisme moléculaire sous-jacent reste inconnu. Ici, nous avons effectué un dépistage à grande échelle des récepteurs couplés aux protéines G en combinaison avec la modélisation structurelle et avons découvert que le remdesivir est un agoniste partiel sélectif du récepteur de l'urotensine-II (UTS2R) via l'axe AKT/ERK dépendant de Gαi/o. Sur le plan fonctionnel, le traitement au remdesivir a induit un potentiel de champ prolongé et l'APD90 dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines induites (iPS) et une contractilité altérée dans les cardiomyocytes néonataux et adultes, qui reflètent tous la pathologie clinique. Il est important de noter que les dysfonctionnements cardiaques médiés par le remdesivir ont été efficacement atténués en antagonisant la signalisation UTS2R. Enfin, nous avons caractérisé l'effet de 110 variants mononucléotidiques dans le gène UTS2R signalés dans la base de données du génome et avons trouvé quatre variants faux-sens qui montrent des effets de gain de fonction dans la sensibilité du récepteur au remdesivir. Collectivement, notre étude met en lumière un mécanisme jusque-là inconnu sous-jacent aux événements cardiovasculaires liés au remdesivir et que les variations génétiques du gène UTS2R peuvent être un facteur de risque potentiel d'événements cardiovasculaires pendant le traitement au remdesivir, ce qui ouvre collectivement la voie à une opportunité thérapeutique pour prévenir de tels événements à l'avenir.

Les analogues de nucléosides ont une longue histoire dans le domaine de la conception de médicaments pour le traitement antiviral, car les nucléosides sont utilisés comme blocs de construction pour la synthèse d'ADN et d'ARN pendant la réplication virale1. Le principal mécanisme des activités antivirales des analogues nucléosidiques est attribué à l'inhibition de l'ARN polymérase virale dépendante de l'ARN2. En réponse à la pandémie mondiale de COVID-19, plusieurs analogues nucléosidiques, tels que le remdesivir, le molnupiravir et le favipiravir, ont été développés pour traiter la maladie.

Le remdesivir (GS-5734 ; Veklury) est un analogue modifié de l'adénosine qui contient un fragment de promédicament de McGuigan, comprenant du phénol et de l'ester éthylbutylique de l-alanine, ce qui augmente sa lipophilicité et sa perméabilité cellulaire3. Après administration intraveineuse, le remdesivir est rapidement converti en forme mononucléoside (GS-441524) et est métabolisé de manière intracellulaire par plusieurs enzymes hôtes en sa forme triphosphate pharmacologiquement active, qui, à son tour, agit comme un inhibiteur puissant et sélectif de l'ARN polymérase dépendante de l'ARN de plusieurs virus4,5. Le remdesivir a été initialement utilisé pour le traitement du virus Ebola6 et a été approuvé pour le traitement de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) au milieu de la pandémie mondiale. Le remdesivir a raccourci le temps de récupération chez les adultes hospitalisés pour COVID-19 et présentant des signes d'infection des voies respiratoires inférieures7. Des données plus récentes ont démontré une réduction significative des hospitalisations avec une cure de 3 jours de remdesivir intraveineux8. Bien que le remdesivir soit généralement bien toléré par la plupart des individus, des effets indésirables courants du remdesivir ont été signalés, notamment des éruptions cutanées, des maux de tête, des nausées, de la diarrhée et des transaminases élevées7. Les directives actuelles pour le remdesivir suggèrent une surveillance attentive de la fonction hépatique pendant le traitement et déconseillent son utilisation chez les patients présentant un dysfonctionnement rénal9. De plus, des événements cardiovasculaires, y compris l'hypotension, la bradycardie, l'allongement de l'intervalle QT et l'anomalie de l'onde T, ont été signalés10,11,12,13. Lorsqu'il est administré par voie intraveineuse, le remdesivir présente une large distribution tissulaire, y compris dans le cœur14, mais le mécanisme moléculaire précis sous-jacent aux effets secondaires cardiovasculaires du remdesivir reste incertain.

Le molnupiravir (EIDD-2801/MK-4482 ; Lagevrio) a été autorisé pour une utilisation d'urgence par la FDA dans le cadre d'une autorisation d'utilisation d'urgence pour le traitement du COVID-19 léger à modéré chez les adultes qui présentent un risque élevé de progression vers un COVID-19 sévère. Le molnupiravir est un analogue oral de la cytosine qui contient un promédicament isopropylester de la β-d-N4-hydroxycytidine (NHC). La forme active du NHC est un substrat de l'ARN polymérase virale dépendante de l'ARN et altère la fidélité de la réplication du SRAS-CoV-2, provoquant une catastrophe d'erreur15. Un essai clinique chez des adultes non hospitalisés a montré qu'un traitement précoce par le molnupiravir réduisait efficacement le risque d'hospitalisation ou de décès chez les adultes à risque non vaccinés atteints de COVID-1916. En plus du molnupiravir, le favipiravir (T-705; Avigan), qui est un médicament antigrippal, a fait l'objet d'essais cliniques pour le traitement de la COVID-19. Le favipiravir est un analogue de nucléobase dérivé du pyrazine carboxamide (6-fluoro-3-hydroxy-2-pyrazinecarboxamide)17. Les modes d'action suggérés du favipiravir comprennent un mélange d'événements de terminaison de chaîne et de mutation18. Plusieurs effets indésirables ont été signalés lors de l'utilisation du molnupiravir et du favipiravir, notamment des diarrhées, des étourdissements et des nausées pour le molnupiravir19, ainsi qu'une hyperuricémie et une augmentation de l'alanine aminotransférase pour le favipiravir20. Surtout, contrairement au remdesivir, aucun effet secondaire cardiovasculaire n'a été signalé avec l'utilisation du molnupiravir ou du favipiravir.

En plus de leur fonction de blocs de construction pour la synthèse d'ADN/ARN, les nucléotides/nucléosides peuvent agir comme des ligands endogènes pour les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) et induire diverses réponses physiopathologiques21,22,23,24,25. Compte tenu de la présence de structures imitant les nucléosides dans le remdesivir, le molnupiravir et le favipiravir, nous avons émis l'hypothèse que ces médicaments pourraient provoquer des effets secondaires en activant directement le GPCR. Nous rapportons ici que le remdesivir, mais pas le molnupiravir et le favipiravir, est un ligand sélectif du récepteur de l'urotensine-II (UTS2R) et provoque un dysfonctionnement cardiaque.

Nous avons criblé des médicaments anti-COVID-19, notamment le remdesivir, le molnupiravir et le favipiravir, contre 348 RCPG à l'aide d'un test d'excrétion du facteur de croissance transformant α (AP-TGFα) marqué à la phosphatase alcaline26. Nous avons utilisé des protéines chimériques de la sous-unité Gα pour le criblage initial afin de détecter efficacement l'activation du récepteur quel que soit le type de sous-unité Gα impliquée26. Parmi les trois médicaments, nous avons découvert que le remdesivir est un activateur sélectif du récepteur de l'urotensine-II (UTS2R) (Fig. 1a, Fig. 1a supplémentaire, Données supplémentaires 1). Comme le remdesivir a puissamment induit une réponse UTS2R sans aucune protéine Gα chimérique, l'analyse UTS2R ultérieure a été réalisée sans l'ajout exogène de la protéine Gα chimère. Une analyse concentration-réponse a révélé que la concentration efficace demi-maximale (pCE50) du remdesivir était de 4,89 ± 0,03 (CE50 = 13 ± 0,9 μM, Fig. 1b à gauche). Il convient de noter que la puissance et l'efficacité du remdesivir (Emax = 47 ± 1,4 % de libération d'AP-TGFα) vis-à-vis de l'UTS2R sont inférieures à celles du ligand peptidique endogène urotensine-II (UT2, pEC50 = 10,72 ± 0,04 ; EC50 = 21 ± 2,1 fM, Emax = 59 ± 0,70 % de libération d'AP-TGFα , figure 1b à droite). Néanmoins, l'administration de remdesivir à une posologie clinique est considérée comme étant dans la plage de travail des effets agonistes car la concentration plasmatique maximale de remdesivir atteint 9,03 μM après injection intraveineuse chez l'adulte sain27. Fait intéressant, contrairement à UT2, le remdesivir n'a pas réussi à induire une réponse de recrutement de la β-arrestine (Fig. 1c, Fig. 1b supplémentaire).

a Structures chimiques des composés testés et cartes thermiques montrant les niveaux relatifs d'activation du GPCR tels que mesurés par le test de perte de TGFα. L'échelle de couleurs représente le % d'activation du GPCR par rapport à l'activation du récepteur médiée par le TPA (12-O-tétradécanoylphorbol 13-acétate), qui induit la réponse maximale de rejet de TGFα indépendamment du GPCR. La cellule jaune représente l'activation de l'UTS2R par le remdesivir. Les concentrations des composés testés étaient de 10 μM pour le remdesivir, le molnupiravir, le GS-441524 et le sofosbuvir, et de 100 μM pour le favipiravir (n = 3). b Courbes de réponse à l'élimination du TGFα pour l'UTS2R par le remdesivir (à gauche) et l'urotensine-II (UT2, à droite) en présence ou en l'absence d'urantide, un antagoniste de l'UTS2R (les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM, n = 3). La concentration efficace demi-maximale (pEC50) du remdesivir était de 4,89 ± 0,03 (EC50 = 13 μM, Emax = 47 ± 1,4 % de libération d'AP-TGFα). La concentration efficace demi-maximale (pEC50) d'UT2 était de 10,72 ± 0,04 (EC50 = 21 fM, Emax = 59 ± 0,70 % de libération d'AP-TGFα). c Test de recrutement de la β-arrestine 1 médié par le remdesivir (à gauche) ou l'urotensine-II (UT2, à droite) pour l'UTS2R. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM (n = 3). d, e Test de liaison compétitive utilisant le peptide biotine-UT2. La fraction membranaire des cellules HEK293 exprimant FLAG-UTS2R (input) a été incubée avec de la biotine-UT2 en présence ou non de remdesivir ou d'urantide. FLAG-UTS2R a été abaissé par des billes magnétiques recouvertes de streptavidine (M280) et FLAG-UTS2R a été détecté par Western blot. d Une image représentative de trois essais indépendants a été montrée. e Densitométrie de bande. ***p < 0,001 et **p < 0,01 versus véhicule + groupe UT2 10 μM (ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett) ; signifie ± SEM.

Pour évaluer si le remdesivir peut interagir directement avec UTS2R, nous avons effectué un test de liaison compétitive. Une étude précédente a montré qu'un peptide UT2 synthétique avec une étiquette de biotine N-terminale (biotine-UT2) peut former une liaison stable avec UTS2R28. Fait important, la liaison était suffisamment stable pour la réduction biochimique de l'UTS2R à l'aide de la résine de streptavidine. Tirant parti de la propriété unique du peptide biotine-UT2, nous avons effectué un test pulldown en utilisant une fraction membranaire de cellules HEK293 exprimant UTS2R en présence ou en l'absence de remdesivir (Fig. 1c supplémentaire). Parmi les différents types de billes magnétiques que nous avons testées, les billes magnétiques à revêtement hydrophobe ont montré l'efficacité de pulldown maximale avec une faible liaison non spécifique (Fig. 1d supplémentaire). En utilisant le protocole optimisé, nous avons constaté que le remdesivir et l'uranide altéraient de manière significative le pulldown UTS2R médié par la biotine-UT2 (Fig. 1d, e, Fig. 1e supplémentaire). Ces résultats suggèrent que le remdesivir peut interagir directement avec UTS2R, interférant ainsi avec la liaison biotine-UT2-UTS2R.

Nous avons en outre étudié si les métabolites du remdesivir activaient l'UTS2R. GS-441524 et GS-704277, les métabolites majeur et mineur du remdesivir6,27, respectivement, n'ont montré aucun effet sur l'activation de l'UTS2R (Fig. 1a, Fig. 1a supplémentaire). Pour déterminer si le fragment promédicament McGuigan est responsable de l'activation de l'UTS2R du remdesivir, nous avons testé le sofosbuvir (GS-7977), un promédicament de classe McGuigan3 approuvé par la FDA, contre l'UTS2R. Cependant, le sofosbuvir n'a pas activé l'UTS2R (Fig. 1a, Fig. 1a supplémentaire). Ces résultats suggèrent que le fragment promédicament McGuigan et la base nucléosidique du remdesivir sont nécessaires pour activer le récepteur.

UTS2R appartient à la famille des GPCR de classe A29 et comprend les 7 hélices transmembranaires canoniques (TM), l'hélice amphipathique 8 à l'extrémité C-terminale (H8), deux brins β antiparallèles dans la boucle extracellulaire 2, un domaine N-terminal relativement court avec deux sites de N-glycosylation et une ancre de palmitoylation à la queue C-terminale (Fig. 2a en haut). Pendant ce temps, le remdesivir est un analogue de l'adénosine et un promédicament phosphoramidate de la classe McGuigan (phénol et ester éthylbutylique de l-alanine), qui masque la fraction phosphate anionique du remdesivir, améliorant ainsi l'administration du médicament. Pour élucider davantage la base moléculaire de la liaison ligand-récepteur, nous avons effectué un amarrage structurel in silico de l'UTS2R en présence de remdesivir (Fig. 2a plus bas). Notre analyse a montré plusieurs résidus d'acides aminés dans la poche orthostérique qui stabilisent potentiellement la liaison au remdesivir. Premièrement, le groupe cyano du nucléosucre du remdesivir forme une liaison hydrogène avec le résidu UTS2R T3047.42×41 (les exposants indiquent le système de numérotation GPCR générique30). Deuxièmement, le groupe phényle du fragment promédicament McGuigan du remdesivir est coiffé de N2977.35×34. Enfin, le groupe amino de la nucléobase du remdesivir forme une liaison hydrogène avec M1343.36 au fond de la poche (liaison hydrogène NH···S31).

un panneau supérieur, schéma de l'UTS2R ; Panneau inférieur, modèle Docking de l'UTS2R avec remdesivir. La structure AlphaFold de l'UTS2R humain est représentée par des rubans verts, en omettant TM5 pour plus de clarté. Le remdesivir et les chaînes latérales sélectionnées du récepteur sont représentés sous forme de bâtonnets et de couleur grise et verte, respectivement. Les lignes pointillées noires indiquent les liaisons hydrogène. b, c Effets des mutations indiquées sur l'activation des récepteurs médiés par le remdesivir (b) ou UT2 (c). L'axe des y (valeur ⊿pEC50) représente la puissance d'activation relative de chaque récepteur mutant par rapport au récepteur WT. ⊿ valeur pEC50 = mutant pEC50 - pEC50 WT. La valeur seuil ⊿pEC50 a été fixée à -1, comme indiqué par les lignes en pointillés. Les valeurs d'EC50 ont été déterminées par le dosage TGFα-shedding. **p < 0,01, ***p < 0,001 vs WT par ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Dunnett. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM (n ≥ 3).

Pour valider le modèle d'amarrage, nous avons muté ces résidus UTS2R (T3047.42 × 41, N2977.35 × 34 et M1343.36) en d'autres acides aminés et testé si ces mutations affectaient l'activation de l'UTS2R médiée par le remdesivir (Fig. 2b, c, Fig. 2a, b). Conformément à la simulation in silico, la mutation des trois résidus a presque complètement aboli le pouvoir d'activation du remdesivir en UTS2R, indiquant que le remdesivir doit contacter UTS2R sur plusieurs résidus pour obtenir une liaison stable. Le nucléoside et le fragment McGuigan sont essentiels pour la liaison au récepteur, N2977.35 × 34 interagissant avec le fragment McGuigan et M1343.36 et T3047.42 × 41 interagissant avec le fragment nucléoside. Cette observation structurelle explique pourquoi la mutation d'un seul acide aminé réduit considérablement l'activité du remdesivir vis-à-vis de l'UTS2R. Cette explication est en outre étayée par le résultat selon lequel UTS2R ne répond à aucun métabolite du remdesivir, dont le fragment McGuigan est éliminé métaboliquement. En revanche, ces mutations n'ont réduit que partiellement l'activation de l'UTS2R médiée par UT2. Pendant ce temps, contrairement à ces trois résidus, nous avons constaté que D1303.32 a un effet inhibiteur sur la liaison remdesivir-UTS2R. La mutation D1303.32N a aboli l'activation de l'UTS2R médiée par UT2, mais a significativement régulé à la hausse l'activation du récepteur médiée par le remdesivir (Fig. 2b, c, Fig. 2a, b supplémentaires). Selon le modèle d'amarrage, le résidu D1303.32 est localisé près de la fraction nucléobase du remdesivir (Fig. 2a). Nous supposons que la charge négative du résidu D1303.32 peut induire un effet de répulsion des électrons32, conduisant à une déstabilisation de l'interaction entre le résidu D1303.32 et la nucléobase. Ces résultats démontrent que l'activation de l'UTS2R médiée par le remdesivir est médiée par une liaison spécifique entre l'UTS2R et son fragment promédicament McGuigan et sa base nucléosidique, qui diffère de celle de l'UTS2R et du ligand endogène.

Pour déterminer si l'activation de l'UTS2R médiée par le remdesivir induit une transduction de la signalisation intracellulaire, nous avons stimulé les cellules HEK293 exprimant l'UTS2R avec du remdesivir et examiné l'état de phosphorylation de la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) 1/2. L'application de remdesivir jusqu'à 72 h a évoqué une phosphorylation durable et dose-dépendante de ERK1/2 (Fig. 3a, Fig. 3a supplémentaire). Il est important de noter que la phosphorylation de ERK médiée par le remdesivir a été abolie par l'antagoniste UTS2R (Fig. 3a, Fig. 3a supplémentaire). La réponse de ERK1/2 induite par le remdesivir était similaire à celle induite par UT2 (Fig. 3b supplémentaire).

a Des cellules HEK293 privées de sérum surexprimant UTS2R ont été stimulées avec les concentrations indiquées de remdesivir pendant 5 min avec ou sans urantide, un antagoniste de l'UTS2R, et les lysats ont été soumis à une analyse par transfert Western. Les rapports d'activation de ERK1 et ERK2 (pERK1/ERK1 et pERK2/ERK2) ont été calculés avec des données normalisées au véhicule. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 par le test de comparaisons multiples de Tukey. Les données sont représentées sous forme de moyennes ± SEM (n = 3). b À gauche, corrélation temporelle entre la durée du potentiel de champ et l'intervalle QT sur l'ECG de surface. À droite, schéma de la plate-forme multiélectrode array (MEA). c Forme d'onde de potentiel de champ représentative dans des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hiPSC-CM) traités avec 1 µM de remdesivir en présence ou en l'absence d'urantide pendant 72 h. d Effet du remdesivir et de l'urantide sur la prolongation du potentiel de champ dans les hiPSC-CM. *p < 0,05, **p < 0,01 par ANOVA à deux facteurs suivi des tests de comparaisons multiples de Šídák. Les données sont représentées sous forme de moyennes ± SEM (n = 3). e Patch-clamp perforé pour enregistrer les potentiels d'action spontanée des hiPS-CM dans les modèles de pinces de courant. Les hiPSC-CM ont été traités avec du remdesivir 10 µM en présence ou en l'absence d'urantide 50 µM pendant 72 h. *p < 0,05 et **p < 0,01 par le test de comparaisons multiples de Tukey. Les données sont représentées sous forme de moyennes ± SEM (n ≥ 3).

UT2 et son récepteur UTS2R sont largement exprimés dans les tissus, avec une expression relativement élevée dans les systèmes cardiovasculaires33 (Fig. 3c, d supplémentaires). Incités par le potentiel cardiotoxique du remdesivir10,11,12,13, nous avons évalué l'impact du remdesivir sur les fonctions des cardiomyocytes. Nous avons examiné l'effet du remdesivir sur le potentiel de champ (FP) à l'aide de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC-CM)34, dans lesquels le niveau d'expression de l'UTS2R est comparable à celui du cœur humain (Fig. 3e supplémentaire). La durée FP (FPD) est en étroite corrélation avec l'intervalle QT sur un électrocardiogramme (ECG)35 (Fig. 3b à gauche). Notamment, l'allongement de l'intervalle QT a été lié à la survenue d'arythmies graves et potentiellement mortelles, et l'allongement de l'intervalle QT est la principale cause de toxicité cardiovasculaire induite par les médicaments36. Pour l'évaluation du FPD, l'utilisation d'une plate-forme multiélectrodes (MEA) est bien acceptée pour sa capacité à surveiller l'électrophysiologie des cardiomyocytes au niveau de la population cellulaire (Fig. 3b à droite)35. Une analyse MEA a révélé que les hiPSC-CM traités avec du remdesivir présentaient un FPD prolongé de 1,32 ± 1,38 % à 24 h, 5,60 ± 1,60 % à 48 h et 15,57 ± 3,49 % à 72 h, respectivement. Notamment, la prolongation a été significativement supprimée par l'antagoniste UTS2R (Fig. 3c, d). En effet, l'application de l'antagoniste UTS2R avec le remdesivir n'a montré presque aucun retard FPD à 24 h (-1,71 ± 1,60%) et 48 h (-0,61 ± 0,11%), tandis que l'effet d'inversion était toujours significatif mais est devenu partiel à 72 h (Fig. 3d).

En plus du FPD, nous avons évalué l'allongement de l'intervalle QT par patch-clamp perforé et enregistré les potentiels d'action spontanés des hiPS-CM. Nous avons mesuré l'APD90 (durée du potentiel d'action à 90 % de repolarisation). Le remdesivir a prolongé de manière significative l'APD90 dans les hiPS-CM, et cette prolongation a été nettement atténuée par l'administration d'urantide (Fig. 3e). Ainsi, ces résultats élucident un mécanisme jusqu'alors inconnu des risques proarythmiques rapportés du remdesivir11,12,13, qui dépend au moins partiellement de l'UTS2R. Ensuite, nous avons évalué les effets du remdesivir sur la contractilité cardiaque. À cette fin, nous avons utilisé des cardiomyocytes de rat néonatal (NRCM) et évalué la force de contraction. Dans le cadre d'un protocole de stimulation constante, les NRCM sous traitement chronique au remdesivir ont montré une contractilité réduite, qui a été significativement atténuée par l'antagoniste UTS2R (Fig. 4a).

a, b Gauche, forme d'onde représentative de la contractilité sous stimulation dans les cardiomyocytes de rat néonatal (NRCM) par 1 µM de remdesivir avec ou sans urantide ou b toxine coquelucheuse (PTX), un inhibiteur de Gαi/o et YM-254890, un inhibiteur de Gαq/11, à 48 h. À droite, l'effet du remdesivir avec un urantide ou b PTX et YM-254890 sur la contractilité sous stimulation dans les NRCM. **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 par le test de comparaisons multiples de Tukey. Les données sont représentées sous forme de moyennes ± SEM (n = 3). c, d Western blot représentatif de la phosphorylation de c ERK1/2 et d protéine kinase B (AKT). Des cellules HEK293 privées de sérum surexprimant UTS2R ont été stimulées avec les concentrations indiquées de remdesivir pendant 48 h. Pour l'inhibition de la protéine Gi/o, les cellules ont été incubées avec du PTX pendant au moins 18 h à 150 ng/mL. Les ratios d'activation de ERK1, ERK2 et AKT ont été calculés avec des données normalisées par rapport au véhicule. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 par le test de comparaisons multiples de Tukey. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM (n = 3). e, f Les effets du remdesivir sur la contractilité des cardiomyocytes de souris adultes. Des cardiomyocytes de souris adultes isolés ont été traités avec du remdesivir (10 µM) pendant 30 min, et le changement de centile dans la surface cellulaire (e) et le rapport de raccourcissement des cardiomyocytes (f) ont été mesurés pendant la stimulation électrique. ****p < 0,001 par test t non apparié. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM (un total de 54 cellules de 3 souris).

Les protéines G hétérotrimériques, y compris Gαs, Gαi/o, Gαq/11 et Gα12/13, sont les effecteurs en aval des GPCR. Parmi celles-ci, la famille Gαi/o a été impliquée dans la contractilité myocardique et la fréquence cardiaque via la modulation des canaux ioniques37. Puisque UTS2R est couplé à Gαi/o et Gαq29, nous avons cherché à déterminer quelle protéine Gα est impliquée dans la diminution de la contraction myocardique induite par le remdesivir. L'inhibiteur de Gαi/o, la toxine de la coqueluche (PTX), mais pas l'inhibiteur de Gαq/11 YM-254890, a complètement bloqué l'effet du remdesivir et restauré les contractions maximales des NRCM (Fig. 4b). Une étude précédente a démontré comment l'activation de Gαi/o dans les NRCM conduit à la libération de Gβγ, qui active PI3K de manière intracellulaire, conduisant à l'activation de AKT et ERK1/238. Conformément à cette observation, l'inhibition de Gαi/o a réduit la phosphorylation induite par le remdesivir de ERK1/2 et AKT (Fig. 4c, d). Ces résultats suggèrent que le remdesivir réduit la contractilité des cardiomyocytes par la voie de transduction du signal AKT/ERK dépendante de Gαi/o. Collectivement, nos résultats indiquent que le remdesivir lui-même peut fonctionner comme un ligand exogène de l'UTS2R. De plus, nous avons identifié le potentiel proarythmique et inotrope négatif du remdesivir, tous deux dépendants de l'UTS2R.

Étant donné que les cardiomyocytes néonatals ne sont pas différenciés en phase terminale, nous avons étudié plus en détail l'effet du remdesivir sur les cardiomyocytes matures isolés de cœurs de souris adultes (Fig. 3f supplémentaire). La contraction des cardiomyocytes a été enregistrée dans des conditions de stimulation, et le degré de contraction a été évalué par analyse morphologique. Semblable aux cardiomyocytes néonatals, le remdesivir a considérablement altéré la contraction des cardiomyocytes adultes (Fig. 4e, f).

Une étude précédente a suggéré que la cardiotoxicité liée au remdesivir peut être causée par un dysfonctionnement mitochondrial39 puisque la forme active du remdesivir montre un effet inhibiteur sur l'ARN polymérase mitochondriale (mtRNAP) à forte dose40. Cependant, le traitement par remdesivir à 10 μM, qui équivaut à la concentration plasmatique maximale après l'administration de remdesivir chez l'homme27, n'a pas affecté les niveaux à l'état d'équilibre des protéines du complexe respiratoire mitochondrial (Fig. 3g, h supplémentaire).

Pour comprendre l'impact de la variance génétique sur la sensibilité à la signalisation remdesivir-UTS2R chez l'homme, nous extrayons des informations sur le variant mononucléotidique (SNV) d'une base de données génomique qui comprend le 14KJPN Genome Reference Panel, qui est une base de données génomique basée sur la population à grande échelle construite à partir de la séquence d'ADN de 14 000 individus japonais41, suivie d'un test fonctionnel sur l'activation du récepteur. Un total de 2178 variantes sont signalées dans le locus UTS2R, dont 139 variantes sont des variantes faux-sens (Données supplémentaires 2). Un nombre considérable de SNV faux-sens répertoriés dans le 14KJPN sont également signalés dans la base de données gnomAD (https://gnomad.broadinstitute.org), qui contient des SNV d'ethnies plus larges.

En conséquence, nous avons généré 110 mutants faux-sens correspondant aux SNV humains dans le gène UTS2R. Nous avons exclu 29 mutations faux-sens dans la région 5′ de UTS2R car le score de confiance pour la prédiction structurelle de l'extrémité N-terminale était relativement faible. Parmi les 110 SNV faux-sens, 44 SNV ont montré une diminution de la sensibilité au remdesivir par rapport au récepteur WT (⊿pEC50 <−0,3, ce qui correspond à une augmentation de plus du double de la CE50 par rapport au récepteur WT ; Fig. 5a panneau supérieur). Pendant ce temps, 47 SNV affichaient une sensibilité réduite à UT2 par rapport au récepteur WT, dont 18 SNV chevauchaient ceux qui présentaient une sensibilité réduite au remdesivir (Fig. 5a panneau inférieur, Fig. 4a supplémentaire). Notamment, nous avons trouvé quatre SNV faux-sens (G681.49C, D1303.32G, V15934.54M et A249ICL3G) qui peuvent augmenter la sensibilité du récepteur au remdesivir par rapport au récepteur WT (⊿pEC50 > 0,3, ce qui correspond à une EC50 inférieure à 0,5 fois par rapport au récepteur WT ; Fig. 5a–c). De plus, parmi ces quatre SNV UTS2R sensibles au gain de fonction remdesivir, les mutants G681.48C et D1303.32G présentaient à l'inverse une diminution de la sensibilité envers UT2, tandis que les mutants V15934.54M et A249ICL3 présentaient une augmentation modérée ou insignifiante de la sensibilité UT2 (⊿pEC50 < 0,3 ; Fig. 5c, Fig. .4a). Collectivement, les résultats suggèrent que les individus porteurs d'une mutation G681.49C, D1303.32G, V15934.54M ou A249ICL3G dans le gène UTS2R sont sensibles au remdesivir, ce qui les rend peut-être plus sensibles à la cardiotoxicité médiée par UTS2R, bien que les fréquences alléliques des variantes de gain de fonction soient faibles (Fig. 4b supplémentaire).

a Effets de 110 SNV faux-sens du gène UTS2R sur (panneau supérieur) l'activation des récepteurs médiés par le remdesivir et (panneau inférieur) par l'UT2, mesurés par le test de perte de TGFα. L'axe des y (valeur ⊿pEC50) représente la puissance d'activation relative de chaque récepteur mutant par rapport au récepteur WT. La valeur seuil ⊿pEC50 a été fixée à -1, comme indiqué par les lignes en pointillés. Les bandes bleu clair représentent la plage de -0,3 <⊿pEC50 <0,3, ce qui correspond à la plage d'un changement de 0,5 à 2 fois (moins de 2 fois) de la CE50 du récepteur mutant par rapport au récepteur WT. Toutes les expériences ont été réalisées en triple, et les données sont exprimées sous forme de moyennes. b Diagramme de diagramme de serpent d'UTS2R montrant les emplacements des mutations et leurs effets sur la puissance du remdesivir (modifié de www.gpcrdb.org). c Effets des mutations sélectionnées sur l'activation des récepteurs médiée par le remdesivir (à gauche) et (à droite) par l'UT2. Les valeurs EC50 sont déterminées par le dosage TGFα-shedding. "ns" p > 0,05 et ****p < 0,0001 par rapport à WT par ANOVA unidirectionnelle suivie des tests de comparaisons multiples de Dunnett. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SEM (n ≥ 3).

Suite à l'achèvement de l'Adaptive COVID-19 Treatment Trial 1 (ACTT-1)7, qui a démontré la supériorité du remdesivir sur le placebo pour améliorer le temps de récupération des patients hospitalisés pour la COVID-19, le remdesivir a été l'un des médicaments les plus couramment prescrits aux patients hospitalisés pour une infection à la COVID-19. Il est important de noter que les enquêteurs de l'ACTT-1 ont rapporté que 0,2 % des patients recevant du remdesivir, mais pas des patients recevant un placebo, présentaient des arythmies (autres que la fibrillation auriculaire, la tachycardie supraventriculaire, la tachycardie ventriculaire et la fibrillation ventriculaire), bien que ces effets cardiovasculaires n'aient pas été considérés comme des effets indésirables. Cependant, le pourcentage de patients souffrant d'arythmie pourrait être sous-estimé puisque les premiers essais cliniques ne sont pas suffisamment puissants pour détecter des événements indésirables peu fréquents42. En effet, une vaste étude de cohorte rétrospective de pharmacovigilance, qui a utilisé les dossiers médicaux de plus de 130 pays et de 20 millions de patients, a rapporté que l'arrêt cardiaque, la bradycardie et l'hypotension sont associés à l'utilisation du remdesivir10. L'élévation de la concentration plasmatique de remdesivir est associée à une augmentation de la durée de FP avec une diminution des amplitudes des pics de Na+ et des taux de battements spontanés, ce qui pourrait potentiellement induire un intervalle QT prolongé et une torsade de pointe43,44. Il est important de noter que les effets indésirables cardiaques semblent être directement causés par le remdesivir, car ils ont été signalés comme résolutifs dans les 24 à 48 h suivant l'arrêt du remdesivir45,46. À ce jour, le mécanisme précis sous-jacent aux effets secondaires cardiaques du remdesivir est resté flou, sans aucun moyen de prédire les populations sensibles à ses effets secondaires cardiaques et sans traitement spécifique de la cardiotoxicité. Par conséquent, il est urgent de comprendre comment le remdesivir induit un dysfonctionnement cardiaque.

En utilisant une stratégie de dépistage par GPCR impartiale et à grande échelle, nous avons identifié que le remdesivir, mais pas le molnupiravir et le favipiravir, peut activer sélectivement l'UTS2R. L'interaction entre le remdesivir et l'UTS2R a été étayée par le test de liaison compétitive utilisant le peptide biotine-UT2. Fait intéressant, UTS2R est fortement exprimé dans le tissu cardiaque, y compris les cardiomyocytes. L'activation de l'UTS2R par l'urotensine-II (UT2), le ligand endogène de l'UTS2R, a été impliquée dans la dysfonction cardiaque. Par exemple, le niveau plasmatique d'UT2 et le niveau d'expression d'UTS2R dans les cardiomyocytes sont élevés chez les patients atteints d'insuffisance cardiaque congestive en phase terminale47. Conformément à ces études précédentes, nous avons constaté que l'activation de l'UTS2R par le remdesivir à une concentration de 1 μM induisait des anomalies électriques et une altération de la force de contraction dans les cardiomyocytes en culture, qui ressemblent toutes deux aux effets secondaires cardiaques rapportés chez l'homme. De plus, ces effets indésirables ont été efficacement bloqués en antagonisant UTS2R ou en inhibant sa signalisation en aval. Cliniquement, le remdesivir est administré par voie intraveineuse à une dose de 200 mg une fois, suivie de 100 mg par jour pendant un total de 5 à 10 jours chez les adultes et les enfants ≥ 40 kg. La concentration plasmatique maximale estimée du remdesivir est de 9,03 μM chez l'adulte sain et peut être plus élevée chez les patients atteints d'insuffisance rénale ou hépatique en raison de son excrétion rénale et biliaire48. Nos résultats suggèrent que la dose clinique de remdesivir est suffisante pour activer l'UTS2R, et les patients atteints d'insuffisance rénale ou hépatique peuvent présenter un risque élevé d'événements indésirables médiés par l'axe remdesivir-UTS2R. Notamment, notre test GPCR a clairement montré que le remdesivir n'a aucun effet sur les récepteurs de l'adénosine, dont l'activation peut également avoir un impact sur les fonctions cardiaques. Ainsi, l'activation de l'UTS2R est probablement responsable des effets secondaires cardiaques.

Une découverte importante de cette étude est que les SNV dans la région codante de l'UTS2R ont des impacts importants sur sa réponse au remdesivir. Ce résultat est conforme aux études précédentes qui montrent que les SNV dans les gènes GPCR sont associés à la physiopathologie de diverses maladies, y compris les maladies CV, et affectent les résultats thérapeutiques49. Alors que 40 % des SNV dans l'UTS2R (44/110) ont montré une réduction d'au moins deux fois la puissance vis-à-vis du remdesivir par rapport au récepteur WT, et 56 % (62/110) n'ont montré aucun changement remarquable (dans la plage d'un changement de 0,5 à 2 fois), nous avons identifié quatre SNV à gain de fonction qui ont montré une augmentation de plus de deux fois en réponse au remdesivir. Notamment, D1303.32G était une variante au même acide aminé pour laquelle nous avons identifié une mutation de gain de fonction (D1303.32N) en utilisant la modélisation in silico, indiquant l'importance du résidu D1303.32 dans la reconnaissance du remdesivir.

L'activation du GPCR induit souvent le recrutement de la β-arrestine vers le récepteur, suivi de l'internalisation du récepteur vers le compartiment intracellulaire. Cette internalisation met fin à l'activation du GPCR et favorise les voies de signalisation secondaires50. Fait intéressant, contrairement au ligand endogène UT2, qui induit efficacement le recrutement de la β-arrestine (Fig. 1c)51, l'activation de l'UTS2R médiée par le remdesivir n'a pas induit le recrutement de la β-arrestine. Ainsi, nos résultats suggèrent que le remdesivir est un ligand biaisé par la protéine G (Fig. 1c, Fig. 1b supplémentaire). Une telle activation biaisée de l'UTS2R par le remdesivir peut avoir un impact important sur la fonction cardiaque d'une manière qui permet une activation prolongée de l'UTS2R sans arrêt médié par la β-arrestine et ainsi une exagération de la signalisation en aval et des effets cardiotoxiques accrus. Cependant, il est également concevable que la puissance modeste du remdesivir ait pu entraver la détection de la réponse β-arrestine. Une étude plus approfondie utilisant une nouvelle méthodologie pour la détection sensible de la réponse β-arrestine est nécessaire pour évaluer l'effet de biais du remdesivir.

Lors de la liaison au ligand, les GPCR, y compris UTS2R, initient un changement conformationnel qui induit l'activation des protéines G hétérotrimériques et la dissociation des complexes de sous-unités Gα et Gβγ. Les protéines Gα comprennent les protéines Gαs, Gαi/o, Gαq/11 et Gα12/13, qui sont responsables de la transduction de signalisation en aval. Les membres de la famille Gαi/o sont largement distribués, y compris dans le système cardiaque, où ils sont fortement exprimés et agissent pour réguler la contractilité myocardique et la fréquence cardiaque via la modulation des canaux ioniques37. Par exemple, la fréquence cardiaque au repos est contrôlée par des signaux cholinergiques médiés par les récepteurs couplés muscariniques M2 Gαi. Ces effets se produisent par inhibition de l'adénylyl cyclase (AC) et par inhibition Gβγ d'un canal potassique dans le nœud sino-auriculaire. Le mécanisme de transduction d'UTS2R est le couplage et l'activation de Gαi/o ainsi que de Gαq29, ce qui est cohérent avec l'implication de l'axe UT2-UTS2R dans la régulation CV par des voies de signalisation complexes, à la fois physiologiquement et pathologiquement. Nos résultats utilisant les NRCM ont clairement montré que la diminution de la contraction myocardique médiée par le remdesivir dépend de Gαi/o, mais pas de Gαq/11 (Fig. 4b). Étant donné que les NRCM ressemblent au phénotype des myocytes auriculaires52, la diminution de la contractilité myocardique sous stimulation constante par le remdesivir indique une altération de la gestion du calcium53, ce qui est cohérent avec le ralentissement de la fréquence cardiaque, un effet secondaire cardiovasculaire distinctif du remdesivir10. De plus, nous avons montré que le remdesivir altérait de manière significative la contractilité des cardiomyocytes adultes (Fig. 4e, f).

Malgré la découverte que le remdesivir peut activer l'UTS2R et provoquer une cardiotoxicité, le manque de preuves cliniques est une limitation majeure de cette étude. Pourtant, comme les fréquences alléliques des variantes de gain de fonction sont faibles (Fig. 4b supplémentaire) et que l'utilisation du remdesivir devrait diminuer en raison de la prévalence récente de la variante Omicron COVID-19 avec ses symptômes plus légers, une étude clinique à grande échelle sur l'association entre la sensibilité au remdesivir et la variance génomique est difficile à exécuter. De plus, nous n'avons pas déterminé les mécanismes moléculaires précis qui induisent le risque proarythmique dépendant de l'UTS2R du remdesivir. Les explications possibles sont la régulation altérée de l'expression des gènes ou le trafic des canaux potassiques ERG, qui sont essentiels à l'activité électrique du cœur54. Alternativement, les effets cardiotoxiques chroniques et cumulatifs de l'axe remdesivir-UTS2R sont cohérents avec un impact en aval sur la traduction et la transcription. Bien que nous n'excluions pas la possibilité que le remdesivir puisse affecter le métabolisme mitochondrial via la transduction du signal UTS2R (Fig. 3f supplémentaire), les données actuelles suggèrent que l'axe remdesivir-UTS2R est le principal hors-cible du remdesivir.

En conclusion, à notre connaissance, il s'agit du premier rapport montrant que le remdesivir est un agoniste sélectif de l'UTS2R et que l'activation de l'UTS2R médiée par le remdesivir sous-tend la cardiotoxicité médicamenteuse. De plus, nous avons découvert que des SNV spécifiques dans UTS2R peuvent augmenter la sensibilité au remdesivir. Ainsi, cette étude fournit des informations mécanistes sur les effets secondaires cardiaques médiés par le remdesivir et l'opportunité thérapeutique de prévenir les événements aversifs à l'avenir.

L'objectif global de cette étude était d'explorer les mécanismes moléculaires de la cardiotoxicité liée au remdesivir dans la thérapie anti-COVID-19. Nous avons d'abord effectué le dépistage par GPCR en utilisant les principaux médicaments anti-COVID-19 comme ligands (n = 3 par GPCR). Nous avons validé les résultats du dépistage GPCR par analyse concentration-réponse et déterminé les valeurs EC50 et Emax du remdesivir par rapport à UTS2R (n = 16). Nous avons également effectué une simulation d'amarrage à l'aide d'AlphaFold et déterminé les principaux résidus d'acides aminés essentiels à la liaison remdesivir-UTS2R, comme l'a démontré une étude de mutagenèse (n ≥ 3). Nous avons ensuite examiné le potentiel cardiotoxique du remdesivir. En utilisant des cardiomyocytes dérivés de hiPS, nous avons constaté que le risque proarythmique du remdesivir est largement médié par l'UTS2R (n = 3). De plus, en utilisant les NRCM, nous avons montré que la diminution de la force de contraction par le remdesivir est médiée par l'axe UTS2R-Gαi/o (n = 3). Enfin, les effets des SNV dans le gène UTS2R sur l'activation des récepteurs médiés par le remdesivir ont été évalués à l'aide d'un test GPCR (n = 3 par SNV).

Le remdesivir (GS-5734), le GS-441524 et le sofosbuvir (GS-7977) ont été achetés auprès de Selleck Chemicals. Le favipiravir a été acheté auprès de Tokyo Chemical Industry. La fibronectine a été achetée chez Sigma-Aldrich. Tous les autres réactifs étaient de qualité analytique et obtenus auprès de sources commerciales.

Pour rechercher des SNV dans UTS2R, nous avons utilisé une base de données publique de 14 000 individus japonais en bonne santé, appelée 14KJPN, publiée par la Tohoku Medical Megabank Organization de l'Université de Tohoku (ToMMo, https://jmorp.megabank.tohoku.ac.jp/)41, qui couvre les données de fréquence des variantes.

Pour mesurer l'activation du GPCR, un test de perte du facteur de croissance transformant α (TGFα) a été effectué26. Brièvement, des cellules HEK293A ont été ensemencées dans une plaque de culture à 12 puits. Un total de 348 plasmides pCAG codant pour un GPCR non marqué, y compris la construction UTS2R, ont été préparés (Données supplémentaires 1). Les mutants UTS2R, dont 110 mutants faux-sens correspondant aux SNV humains dans le gène UTS2R, ont été générés en introduisant des mutations ponctuelles à l'aide d'un kit KOD-Plus-Mutagenesis. Les cellules ont été transfectées à l'aide d'un réactif polyéthylèneimine (PEI) (2,5 µl de 1 mg/ml par puits ci-après ; Polysciences) avec ces plasmides UTS2R (100 ng par puits ci-après), ainsi que les plasmides codant pour le TGFα étiqueté à la phosphatase alcaline (AP) (AP-TGFα ; 250 ng). Les tests d'activation UTS2R ont été effectués avec la protéine G endogène, sauf indication contraire. Les protéines chimériques de la sous-unité Gα (mélange de Gαq/s, Gαq/i1, Gαq/i3, Gαq/o, Gαq/z, Gαq/12, Gαq/13 et Gα16 ; chacune 10 ng) ont été utilisées pour le criblage initial de 348 GPCR (Fig. 1a). Après une culture de 24h, les cellules transfectées ont été récoltées et recueillies par centrifugation. Les cellules ont été mises en suspension dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant de l'HEPES 5 mM (pH 7,4) et ensemencées dans une plaque à 96 puits. Après une incubation de 30 minutes, le composé à tester a été ajouté aux cellules. Après 1 h d'incubation, les milieux conditionnés ont été transférés dans une plaque 96 puits vide. La solution de réaction AP (un mélange de 10 mM de p-nitrophénylphosphate (p-NPP), 120 mM de Tris-HCl (pH 9,5), 40 mM de NaCl et 10 mM de MgCl2) a été ajoutée à des plaques contenant des cellules et des milieux conditionnés. L'absorbance à une longueur d'onde de 405 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Molecular Devices) avant et après 1 h d'incubation des plaques à température ambiante. La libération d'AP-TGFα induite par le composé a été calculée en soustrayant le signal de libération d'AP-TGFα spontané du signal de libération d'AP-TGFα induit par le composé, et les pourcentages ont été ajustés à une courbe concentration-réponse sigmoïde à quatre paramètres à l'aide du logiciel Prism 9 (GraphPad Prism), et les valeurs EC50 et Emax ont été obtenues.

Un test de recrutement de β-arrestine basé sur la complémentation enzymatique NanoBiT a été réalisé55. En bref, des cellules HEK293A ont été ensemencées dans une plaque de culture à 6 puits et transfectées à l'aide d'un réactif PEI (5 µl de 1 mg/ml par puits ci-après) avec un mélange de plasmides constitué de 500 ng de construction ssHA-FLAG-UTS2R-SmBiT (séquence signal N-terminale d'hémagglutinine suivie d'une étiquette d'épitope FLAG, plus SmBiT C-terminal avec un lieur flexible de 15 acides aminés), 100 ng de construction LgBiT-β-arrestine (LgBiT N-terminal avec un lieur flexible de 15 acides aminés) et 400 ng de plasmide vide. Après 24 h de culture, les cellules transfectées ont été récoltées, mises en suspension dans 2 ml de tampon de dosage (Hanks' Balanced Salt Solution contenant 5 mM HEPES (pH 7,4) et 0,01 % d'albumine de sérum bovin) et ensemencées dans une plaque à 96 puits à un volume de 80 µl par puits. De la coelenterazine (20 µl de 50 µM dilués dans le tampon de dosage) a été ajoutée aux plaques cellulaires, suivie d'une incubation à température ambiante pendant 2 h dans l'obscurité. Après la mesure de la luminescence de base à l'aide d'un lecteur de microplaques Spectra Max L (Molecular Devices), du remdesivir ou de l'UT2 (20 µl de concentration 6 ×) a été ajouté. La luminescence a été mesurée toutes les 20 s après l'ajout du composé. Le signal luminescent moyen sur 5 à 10 min a été normalisé à une valeur initiale. Les valeurs de changement de pli ont ensuite été normalisées à celles de la condition traitée par le véhicule et ont été ajustées à une courbe concentration-réponse sigmoïde à quatre paramètres pour obtenir des valeurs EC50 à l'aide du logiciel Prism 9.

Pour le pulldown d'affinité d'UTS2R, un peptide UT2 avec une étiquette de biotine N-terminale et un espaceur GSSG a été synthétisé (Peptide Institute, INC)28. Les cellules HEK293 ont été transfectées avec le plasmide codant FLAG-UTS2R et ont été privées de sérum pendant 6 h avant l'expérimentation. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS glacé. Une solution hypotonique (HEPES 50 mM, pH 7,5 avec des cocktails d'inhibiteurs de protéase) a été ajoutée à la plaque cellulaire, et les cellules ont été récoltées par raclage. Les cellules ont été homogénéisées à l'aide d'un homogénéisateur Dounce (IKA EUROSTAR 20 digital) à 2 000 tr/min pendant 20 coups à 4 ° C, puis homogénéisées à l'aide d'une rupture tissulaire (Qiagen) pendant 5 s à 4 ° C. L'homogénat a été centrifugé à 800 xg pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les cellules intactes et le noyau. Le surnageant a ensuite été centrifugé à 30 000 xg pendant 30 min à 4° (CP80NX, himac). Le culot résultant a été utilisé comme fraction membranaire brute et a été mis en suspension dans une solution hyperosmotique (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 250 mM, EDTA 2 mM avec inhibiteur de protéase).

Ensuite, la suspension de membrane brute a été incubée en présence ou en l'absence de remdesivir pendant 1 h, suivie d'une incubation avec de la biotine-UT2 pendant la nuit. Le complexe UTS2R lié à la biotine-UT2 a été solubilisé à l'aide d'un tampon hyperosmotique contenant un détergent (N-dodécyl-β-D-maltopyranoside; DDM, 5 × CMC) et abaissé à l'aide de billes magnétiques de streptavidine. Les billes appropriées pour l'expérience ont été sélectionnées parmi 5 types (Fig. 1d supplémentaire, kit d'essai de streptavidine Dynabeads, Thermo Fisher et billes magnétiques de streptavidine, NEB) et dénaturées avec un tampon SDS. Les lysats ont ensuite été soumis à une SDS-PAGE suivie d'un western blot utilisant un anticorps anti-FLAG pour détecter FLAG-UTS2R (anticorps monoclonal Sigma M2, 1:2000).

Une structure UTS2R humaine a été préparée à partir de la base de données AlphaFold Protein Structure Database56,57 (AlphaFold Monomer v2.0) en coupant la région N-terminale en forme de couvercle (1–42) avec un faible score pLDDT. Des atomes d'hydrogène ont été ajoutés au récepteur rogné avec le programme Reduce58. Le remdesivir a été ancré dans la poche orthostérique du récepteur par AutoDockFR59 avec 50 évolutions d'algorithmes génétiques et un maximum de 2 500 000 évaluations. Les poses d'amarrage ont été regroupées au seuil de 2 Å, et les cinq premiers groupes ont été inspectés sur la base du critère de la liaison hydrogène entre le récepteur et le remdesivir. Les structures ont été visualisées et analysées avec CueMol et PyMOL (Schrödinger, Inc.). Les fichiers utilisés dans cette étude ont été déposés à Zenodo.

Pour les transferts de pERK, ERK, pAKT, AKT et β-actine, les cellules HEK293A transfectées par UTS2R et privées de sérum ont été stimulées avec 0, 1 ou 1 μM de remdesivir ou 10 ou 100 nM d'UT2. Avant la stimulation avec ces composés, les cellules ont été incubées avec de l'urantide (Peptide Institute) pendant 30 min à 100 nM (pour l'inhibition de l'UTS2R) ou avec 150 ng/mL de toxine coquelucheuse (PTX ; Wako) pendant une nuit (pour l'inhibition de Gαi/o). Pour les transferts de protéines mitochondriales (Total OXPHOS, MT-COI, TFAM et VDAC), 1 ou 10 μM de remdesivir ou 1 ou 10 μM de GS-441524 ont été ajoutés aux cellules HEK293A transfectées par UTS2R pendant 48 h. Des lysats de cellules entières ont été préparés dans du tampon de lyse RIPA (Thermo Fischer Scientific) contenant des inhibiteurs de protéase (Thermo Fischer Scientific) et des inhibiteurs de phosphatase (Nacalai Tesque). Les lysats cellulaires ont été soniqués et clarifiés par centrifugation. Les concentrations de protéines ont été mesurées à l'aide du kit d'analyse de protéines BCA (Pierce) et ont été ajustées à 1 mg/mL, et 10 μg de protéines ont été soumis à un transfert Western pour chaque expérience. Les échantillons ont été séparés à l'aide de gels de polyacrylamide SDS et transférés sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF). Les transferts ont été bloqués avec du lait écrémé à 5% dans du TBS-T (solution saline tamponnée au Tris avec 0, 1% de Tween-20) pendant 1 h, puis sondés à l'aide de divers anticorps primaires. Les anticorps primaires et les dilutions de travail utilisées étaient les suivantes : pERK (AB_331646), 1:2000 ; ERK (AB_330744), 1:2000; pAKT (AB_329825), 1:1000; AKT (AB_329827), 1:1000; βactine (AB_10697039), 1:10000; OXPHOS total (AB_2756818), 1:10000 ; MTCO1 (AB_2084810), 1:2000 ; TFAM (AB_10841294), 1:1000 ; VDAC (AB_2272627), 1:1000. Les antigènes cibles ont été incubés avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP appropriés (signalisation cellulaire) et ont été visualisés par un substrat ECL (GE Healthcare). Les niveaux de protéines phosphorylées ont été normalisés par rapport aux niveaux totaux de la protéine cible (Fig. 3a et 4c, d, Fig. 3a, b supplémentaires). Pour mesurer les protéines mitochondriales (Fig. 3g supplémentaire), les sous-unités OXPHOS, VDAC, MTCO1 et TFAM ont été détectées par des anticorps spécifiques sur différentes membranes PVDF, respectivement. Les niveaux de protéines des sous-unités OXPHOS, MTCO1 et TFAM ont été normalisés au niveau de VDAC.

Pour évaluer l'expression de l'ARNm de l'UTS2R humain (hUTS2R) dans les tissus humains adultes normaux, des ADNc disponibles dans le commerce provenant de divers tissus humains ont été achetés auprès de TaKaRa (des informations détaillées sur les échantillons sont fournies dans les données supplémentaires 3), et 2 ng d'ADNc ont été soumis à une analyse PCR quantitative (qPCR) (Rotor-Gene Q, Qiagen), comme recommandé par les fabricants. Pour évaluer l'expression de l'ARNm de l'UTS2R (mUTS2R) de souris dans les tissus de souris adultes normaux, des souris mâles C57BL/6J ont été achetées auprès de Japan Clea et l'ARN a été isolé à partir de plusieurs tissus. Les échantillons d'ARN ont été rétrotranscrits en ADNc et ont été soumis à une analyse qPCR. Les amorces utilisées pour la quantification relative sont présentées dans les données supplémentaires 4. Les niveaux d'expression de hUTS2R et mUTS2R ont été normalisés par rapport aux gènes domestiques de G3PDH et d'ARNr 18 s, respectivement.

Des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC-CM) ont été achetés auprès de Fujifilm Cellular Dynamics, Inc. (CDI; iCell cardiomyocytes 2.0). Pour préparer la sonde (MED-PG515A, Alpha MED Sciences), les zones d'enregistrement ont été recouvertes de fibronectine et dissoutes dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco pour créer une solution à 50 µg/mL. La zone d'enregistrement a été recouverte de 1 à 2 µL de solution de fibronectine et les sondes ont été incubées à 37 °C pendant au moins 1 h. Les cellules ont été décongelées et mises en suspension dans un milieu de placage de cardiomyocytes iCell (CDI) et plaquées sur les sondes à une densité de 3, 5 × 104 cellules dans un milieu de placage de 2 µL. Les cellules ont été incubées à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 3 à 4 h avant de remplir chaque sonde avec 1 ml de milieu de maintenance des cardiomyocytes iCell (CDI), qui a été utilisé comme milieu de culture. Le milieu a été changé tous les 2 à 3 jours, les cellules étant cultivées dans les sondes pendant 5 à 14 jours pour obtenir une feuille de cardiomyocytes à activité électrique spontanée et synchrone.

L'enregistrement FP a été effectué35,60. Avant de mesurer les FP, les feuilles de cardiomyocytes iCell ont été équilibrées pendant au moins 4 h dans un milieu de culture frais à l'aide d'un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C. Après équilibrage, les sondes ont été transférées dans le système multi-électrodes (MEA) (MED64, Alpha med Scientific) et incubées dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2. La stabilité et la constance des formes d'onde ont été confirmées en surveillant les signaux pendant au moins 30 min. Une fois que les FP ont atteint un état stable, ils ont été enregistrés pendant 10 min au départ, puis 24, 48 et 72 h après le traitement médicamenteux. Les solutions mères de médicaments ont été préparées dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) ou de l'eau distillée à une concentration cible de 1000 fois. La solution mère a été diluée dans un milieu de culture à une concentration finale de 0,1 % de DMSO.

La durée FP (FPD) a été définie comme la durée du premier au deuxième pic de FP35. Le FPD a été corrigé pour le rythme de battement (intervalle inter-pointes (ISI)) avec la formule de Fridericia (Eq. 1), qui était la principale méthode de correction dans cette étude :

Les valeurs ISI et FPD ont été moyennées à partir des 30 derniers battements ou des 30 derniers battements à des moments présentant un ISI et un FPD stables.

La technique du patch-clamp perforé a été utilisée pour enregistrer les potentiels d'action spontanés dans des modèles de pinces de courant de hiPS-CM à 25 °C, à l'aide d'un amplificateur patch-clamp EPC-10 (HEKA, Lambrecht, Allemagne)61. Les hiPS-CM génèrent généralement une automaticité spontanée dans une solution de Tyrode normale. Les potentiels d'action spontanés ont été enregistrés à l'aide d'une pipette polie au feu (résistance, 2,0 à 4,0 MΩ) remplie d'une solution de pipette contenant 70 mM d'aspartate de potassium, 50 mM de KCl, 10 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 3 mM d'adénosine triphosphate (ATP) (sel disodique ; Sigma Chemical Company, St Louis), 5 mM d'EGTA, 5 mM d'HEPES et 0,1 mM Li2-guanosine triphosphate (GTP) (Sigma Chemical Company) (pH ajusté à 7,2 avec KOH). De l'amphotéricine B (Wako Pure Chemical Industries) a été ajoutée à la solution de pipette à une concentration de 100 mg/ml. La lamelle de verre (3 × 5 mm2) contenant des hiPS-CM plaqués dans des boîtes de culture de 35 mm a été placée dans une chambre d'enregistrement avec une solution de Tyrode normale.

Des cardiomyocytes de rat néonatal (NRCM) ont été isolés à partir de ratons Sprague-Dawley (Japan SLC Inc.) les jours postnatals 1 à 362. Les ventricules des ratons ont été disséqués et hachés sur de la glace après anesthésie terminale (inhalation de sévoflurane à 1,5 %) et euthanasie par luxation cervicale. Le tissu haché a été pré-digéré dans 0,05 % de trypsine-EDTA (Gibco) pendant une nuit à 4 °C, puis digéré dans 1 mg/mL de collagénase de type 2 (Worthington) dans du PBS pendant 30 min à 37 °C tout en agitant la fiole (125 tr/min). Les cellules dissociées ont été filtrées sur un tamis cellulaire (70 μm, Falcon) et centrifugées 2 min à 180 xg. Après élimination du surnageant, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans le milieu 12 de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10% de FBS et de 1% de pénicilline et de streptomycine étalés dans une boîte de culture de 10 cm. Les cellules ont été incubées à 37°C dans une atmosphère humidifiée (5% CO2, 95% air) pendant 90 min. Des NRCM flottants ont été collectés et étalés sur des boîtes de culture recouvertes de matrigel. Après 24 h, le milieu de culture a été remplacé par du DMEM sans sérum et incubé pendant plus de 2 jours avant les expériences. Toutes les expérimentations animales ont été examinées et approuvées par les comités d'éthique des Instituts nationaux des sciences naturelles ou par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Kyushu. Toutes les procédures rapportées sont conformes au NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Des NRCM (4 × 105 cellules/puits) ont été ensemencés sur des boîtes à fond de verre de 3,5 cm dans du DMEM sans sérum. Les cellules ont été traitées avec du remdesivir (1 μM) pendant 48 h à 37 °C et 5 % de CO2. Urantide (100 nM) a été ajouté en même temps. La toxine coquelucheuse (PTX ; 150 ng/mL) a été traitée 18 h avant l'ajout du remdesivir, et le YM-254890 (1 μM) a été traité 30 minutes avant l'ajout du remdesivir. Des images microscopiques de NRCM ont été enregistrées pendant 13 s dans des conditions de stimulation. La stimulation de NRCM a été stimulée à 4 V toutes les secondes, avec une fréquence de 10 ms, à l'aide d'un stimulateur électrique (NIHON KOHDEN, SEN-3301). Les données d'imagerie ont été acquises à six images par seconde à l'aide d'un microscope BZ-X800 (Keyence) et analysées à l'aide du logiciel Fiji63.

Des souris C57BL/6J pour l'isolement de cardiomyocytes de souris adultes ont été achetées auprès de Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japon). L'isolement des cardiomyocytes ventriculaires de souris adultes a été réalisé64. Des souris mâles ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane. Le cœur a été rapidement excisé et l'aorte a été clampée avec une petite pince vasculaire. Le cœur a été perfusé de manière antérograde avec un tampon d'isolement (moins de 3 mL) contenant 130 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 0,5 mM de MgCl2, 0,33 mM de NaH2PO4, 25 mM d'HEPES, 22 mM de glucose et 50 μU/mL d'insuline bovine (Sigma) (pH 7,4, ajusté avec du NaOH) additionné de 0,4 mM d'EGTA, suivi par la perfusion de solution enzymatique (10 mL) (tampon d'isolement contenant 1 mg/mL de collagénase de type 2 (Worthington), 0,06 mg/mL de trypsine (Sigma), 0,06 mg/mL de protéase (Sigma) et 0,3 mM de CaCl2). Ensuite, la chambre LV a été retirée et découpée en petits morceaux dans une solution enzymatique contenant 0,2 % d'albumine de sérum bovin (BSA) et 0,7 mM de CaCl2. La suspension tissulaire cellulaire a été filtrée à travers un tamis cellulaire (100 μm, Falcon) et centrifugée pendant 3 min à 50 x g. Après élimination du surnageant, le culot cellulaire a été remis en suspension dans un tampon d'isolement additionné de 0,2 % de BSA et de 1,2 mM de CaCl2 et incubé pendant 7 min à 37 °C. Après centrifugation (50 x g, 3 min), les cellules ont été remises en suspension dans la solution A de Tyrode (contenant 140 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 0,5 mM de MgCl2, 0,33 mM de NaH2PO4, 5,0 mM d'HEPES et 5,5 mM de glucose (pH 7,4)) additionnée de 0,2 % de BSA. Les cellules ont été ensemencées sur des boîtes de base en verre de 35 mm recouvertes de Matrigel (Corning) (IWAKI) et incubées à 37 ° C pendant 30 min. Les cellules ont été utilisées dans les 1 à 6 heures suivant l'isolement.

Des cardiomyocytes de souris adultes isolés ont été traités avec du remdesivir (10 μM) pendant 30 min à 37 °C. Des images microscopiques de cardiomyocytes ont été enregistrées pendant 13 secondes dans des conditions de stimulation. La stimulation des cardiomyocytes a été stimulée à 30 V toutes les secondes avec une fréquence de 10 msec à l'aide d'un stimulateur électrique (NIHON KOHDEN, SEN-3301). Les données d'imagerie ont été analysées à l'aide du logiciel Fiji.

Les analyses statistiques ont été effectuées avec le logiciel Prism (GraphPad) et les méthodes sont décrites dans les légendes des figures. Les symboles sont des valeurs moyennes et les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne (SEM). Les résultats représentatifs d'au moins trois expériences indépendantes sont présentés pour chaque figure, sauf indication contraire dans les légendes des figures.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données sont disponibles dans le texte principal ou dans les documents complémentaires. Les chiffres sous-jacents des données sources sont fournis dans les données supplémentaires 1. Les transferts non recadrés sont présentés dans la figure supplémentaire 5. Les fichiers de simulation d'amarrage moléculaire ont été déposés chez Zenodo.

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Nous sommes reconnaissants pour les suggestions et le soutien technique de tous les membres du Département de biologie et médecine modomiques de l'Université de Tohoku. Nous remercions Y. Takahata et H. Miyamoto pour l'assistance technique et Natalie D. DeWitt pour la lecture critique et l'édition linguistique. Ce travail a été soutenu par un financement fourni par JSPS KAKENHI (Grant nos. JP20K18371, JP22H04628 et JP22H02813 à AO, JP21H05269 et JP22H02772 à MN, JP21H04791 et JP21H051130 à AI, JP21H02659 et JP21 H05265 à FYW et JP21H02634 à Y. Kanda Ce travail a également été soutenu par l'AMED (Grant nos. JP21mk0101189 à Y. Kanda, JP22zf0127007 à AI, 21he2302008j0002 à FYW, BINDS JP22ama121031 à MN et JP20am01 01095 à AI, LEAP JP20gm0010004 à AI), FOREST de JST (Grant nos. JPMJFR220K à AO, JPMJFR215T à AI, JPMJFR205Y à FYW), Moonshot R&D JPMJMS2023 de JST à AI, CREST JPMJCR2024 (20348438) de JST à MN, ERATO JPM JER2002 de JST à FYW, Daiichi Sankyo Foundation of Life Science à AI, Takeda Science Foundation à AO et AI, Uehara Memorial Foundation à AO et AI, Inamori Foundation à AO, la Mitsubishi Foundation à AO, Terumo Life Science Foundation à AO et la Fondation Naito à AO

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Akiko Ogawa, Seiya Ohira.

Département de biologie et de médecine modomiques, Institut du développement, du vieillissement et du cancer (IDAC), Université de Tohoku, Sendai, Miyagi, 980-8575, Japon

Akiko Ogawa, Seiya Ohira et Fan-Yan Wei

École supérieure de médecine, Université de Tohoku, Sendai, Miyagi, 980-8575, Japon

Seiya Ohira

Département de physiologie, École supérieure des sciences pharmaceutiques, Université de Kyushu, Fukuoka, 812-8582, Japon

Yuri Kato, Xinya Mi, Yukina Ishii et Motohiro Nishida

Laboratoire de biochimie moléculaire et cellulaire, École supérieure des sciences pharmaceutiques, Université du Tohoku, 6-3, Aoba, Aramaki, Aoba-ku, Sendai, Miyagi, 980-8578, Japon

Tatsuya Ikuta et Asuka Inoue

Division de pharmacologie, Institut national des sciences de la santé, Kanagawa, 210-9501, Japon

Shota Yanagida et Yasunari Kanda

Division des sciences pharmaceutiques, École supérieure de médecine, de médecine dentaire et des sciences pharmaceutiques, Université d'Okayama, Okayama, 700-8530, Japon

Shota Yanagida

Institut national des sciences physiologiques et Centre de recherche exploratoire sur la vie et les systèmes vivants, Instituts nationaux des sciences naturelles, Okazaki, 444-8787, Japon

Motohiro Nishida

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Les auteurs confirment leur contribution à l'article comme suit : conceptualisation et conception de l'étude : AO, MN, AI et FYW ; collecte de données : AO, SO, Y. Kato, TI, SY, XM, YI et AI ; analyse et interprétation des résultats : AO, Y. Kato, TI, SY, XM, Y. Kanda, MN, AI et FYW rédaction du projet de document : AO, Y. Kato, TI, SY, XM, AI, FYW supervision du projet : Y. Kanda, MN, AI, FYW Tous les auteurs ont examiné les résultats et approuvé la version finale du document.

Correspondance à Motohiro Nishida, Asuka Inoue ou Fan-Yan Wei.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Dipayan Chaudhuri et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation principale : George Inglis.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Ogawa, A., Ohira, S., Kato, Y. et al. L'activation du récepteur de l'urotensine-II par le remdesivir induit un dysfonctionnement des cardiomyocytes. Commun Biol 6, 511 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04888-x

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Reçu : 10 novembre 2022

Accepté : 28 avril 2023

Publié: 12 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04888-x

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